孫青芝, 呂冰潔, 馬伯軍

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

水稻品種“成恢448”是由秈型恢復(fù)系871028與美國稻種Lemont雜交育成的新恢復(fù)系，具有較強的恢復(fù)力，與珍汕97A，岡46，Ⅱ-32A，D62A，K17A和大粒A等多個不育系測交后,F1代的平均結(jié)實率為83.39%，表現(xiàn)出較強的產(chǎn)量雜種優(yōu)勢.該恢復(fù)系也具有較好的廣親和性，與秈稻測驗種南京11和IR36雜交,F1平均結(jié)實率為85.89%；同粳稻測驗種巴利拉、秋光測交,F1平均結(jié)實率為69.04%[1].“成恢448”對稻瘟病具有抗性，但是卻不抗白葉枯病[1-2].本研究小組多年的大田接菌實驗也表明，“成恢448”對白葉枯病多個菲律賓生理小種都顯現(xiàn)高度感病.“成恢448”非常適合抗白葉枯病轉(zhuǎn)基因育種的理論與應(yīng)用研究.目前，許多學(xué)者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法等將抗白葉枯病基因Xa21轉(zhuǎn)移到栽培品種臺北309[3]，IR72[4]，IR64和BG90-2[5]，以及明恢63、珍汕97B、鹽恢559[6]等，但成功的前提之一就是需要建立這些栽培品種的受體系統(tǒng).目前，粳稻日本晴、中花11等的組織培養(yǎng)體系已經(jīng)非常成熟[7-8]，但秈稻的愈傷組織誘導(dǎo)、繼代及分化都相對較難[9-11]，且不同品種的組培條件差異性也較大[12-14].所以，盡管已報道了93-11，IR24和IR6等多個秈稻品種的組培體系研究[15-16]，但是并不適用于所有的秈稻品種.本文利用生物統(tǒng)計學(xué)原理設(shè)計了不同激素濃度配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，優(yōu)化了秈稻“成恢448”的組織培養(yǎng)體系，為該強優(yōu)恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因育種奠定了堅實基礎(chǔ)，同時也為秈稻抗白葉枯病基因的克隆與功能研究提供了一個遺傳轉(zhuǎn)化的受體.

1 材料與方法

1.1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代

用秈稻(Oryza sativa L. ssp. indica)“成恢448”的成熟種子，去殼，挑取顆粒飽滿的穎果，在超凈臺進行如下操作：在70%乙醇溶液中浸種2 min，無菌水清洗3次，轉(zhuǎn)入30%次氯酸鈉溶液180 r·min-1震蕩30 min，無菌水清洗3次，再在1%過氧化氫溶液中180 r·min-1震蕩3 h，最后用無菌水清洗3～5次，放在無菌濾紙上干燥30 min.消毒干燥后的種子鋪在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中.誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS(Murashige & Skoog)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[17]，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麥芽糖、3 g/L植物凝膠，以及不同質(zhì)量濃度的萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和激動素(KT)(各激素的質(zhì)量濃度見表1)，pH=5.8，在28 ℃恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h).誘導(dǎo)2周后，摘下愈傷組織，繼代培養(yǎng)，計算誘導(dǎo)率和每克愈傷組織增質(zhì)量，篩出最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件.

1.2 水稻愈傷組織的分化與植株再生

在超凈臺中，將繼代培養(yǎng)2周的愈傷組織置于不同的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麥芽糖、3 g/L植物凝膠,以及不同質(zhì)量濃度的NAA、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和KT(各激素的質(zhì)量濃度見表2)，pH=5.8,在28 ℃恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h).2周后計算出綠率，1月后計算出苗率.

1.3 各項指標(biāo)的計算方法

愈傷組織誘導(dǎo)2周后，摘下愈傷組織，并稱出愈傷組織的質(zhì)量m1，繼代2周后稱出愈傷組織的質(zhì)量m2，計算每克愈傷組織的增質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

利用已報道的秈稻組織培養(yǎng)的技術(shù)參數(shù)[4,6-8]，誘導(dǎo)“成恢448”的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率非常低，愈傷組織質(zhì)量不好，且容易褐化.為了獲得“成恢448”組織培養(yǎng)的最佳體系，筆者利用正交實驗原理，設(shè)計了不同激素3因素4水平的誘導(dǎo)培養(yǎng)基參數(shù)和3因素3水平的分化培養(yǎng)基參數(shù)，探索了該水稻品種最優(yōu)化的組培體系.

2.1 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長速率

激素2,4-D，NAA和KT在不同程度上能促進愈傷組織的誘導(dǎo).根據(jù)3因素4水平正交實驗方法，設(shè)置了16種含有不同質(zhì)量濃度的NAA，2,4-D和KT的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見表1，編號1～16)，將“成恢448”的種子(成熟胚)接種到培養(yǎng)基上，生長5 d后開始誘導(dǎo)出淡黃色的愈傷組織，14 d長成大塊愈傷組織.經(jīng)統(tǒng)計，16種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率都在50%以上，其中8種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率達到70%以上，而4號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高，達到了93%.在不添加任何激素的對照培養(yǎng)基(見表1，編號17)上，種子只長根和芽，沒有愈傷組織形成.愈傷組織增質(zhì)量即愈傷組織生長速率，可以代表愈傷組織的活性[9].將誘導(dǎo)得到的愈傷組織摘下，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，計算每克愈傷組織增質(zhì)量.如表1所示：在4號培養(yǎng)基上每克愈傷組織增質(zhì)量最高，活性也較好；3號培養(yǎng)基次之；而其他培養(yǎng)基的每克愈傷組織增質(zhì)量均較低，活性較小.

表1 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長速率

不同配比的激素進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，三者表現(xiàn)為綜合作用.對于本實驗中“成恢448”成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)，雖然3號培養(yǎng)基上的每克愈傷組織增質(zhì)量最高，達到(5.09±0.27) g，但其誘導(dǎo)率卻不高，只有65.97%;而4號培養(yǎng)基上的每克愈傷組織增質(zhì)量僅次之，為(4.81±0.64) g，但其愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達到93.54%.因此，4號培養(yǎng)基的激素配比(1.0 mg/L 2,4-D,4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT)最適宜“成恢448”成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代.

2.2 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的分化情況

選取4號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，轉(zhuǎn)移到不同激素配比的分化培養(yǎng)基(見表2，編號18～26)上，15 d時統(tǒng)計出綠率，1月后統(tǒng)計分化率.由表2可知：“成恢448”愈傷組織的出綠率和成苗率普遍較低，雖然每種培養(yǎng)基都能促進少許愈傷組織出現(xiàn)綠點，但絕大部分培養(yǎng)基上的出綠率均在10%以下，成苗率也較低，或沒有成苗(如編號18，20，22，26)；而25號培養(yǎng)基上的出綠率和成苗率分別達到了32.4%和6.0%，高出其他培養(yǎng)基上的數(shù)倍，即1.0 mg/L NAA，2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L KT適宜“成恢448”愈傷組織的分化與植株再生.

“成恢448”成熟胚的組培過程如圖1所示.

表2 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的分化

圖1 “成恢448”成熟胚的組培過程

3 討 論

植物生長調(diào)節(jié)劑在愈傷組織的誘導(dǎo)和分化中起著很大的作用，植物生長素/細胞分裂素的比率高通常促進愈傷組織的萌發(fā)，而比率低則促進愈傷組織的分化.植物生長素2,4-D或NAA對于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖是必需的[18-23].另外，文獻[24]和[25]分別證明了2,4-D與KT配合使用更能促進胚性愈傷組織的形成，而單獨使用2,4-D得到的只是無胚性的愈傷組織.本實驗中，用不添加任何激素的MS培養(yǎng)基(見表1，編號17)誘導(dǎo)“成恢448”愈傷組織時，沒有愈傷組織形成，只瘋長根和苗，而在培養(yǎng)基中添加2,4-D，NAA和KT后均有數(shù)量不等的愈傷組織形成，表明在培養(yǎng)基中添加適量的2,4-D，NAA和KT確實有利于愈傷組織的萌發(fā)，這與文獻[15]對7種秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果是一致的.雖然這3種激素的混合能在不同程度上誘導(dǎo)愈傷組織，但激素間不同濃度的搭配更加至關(guān)重要.當(dāng)2,4-D的質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/L時，愈傷組織的誘導(dǎo)效果均良好，且在1.0 mg/L時每克愈傷組織增質(zhì)量最大，為5.09 g,基本與水稻93-11的5.86 g[26]齊平.而NAA的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)則越高越好，表1中16種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率均不錯，全在50%以上，甚至最高的達到了90%以上，超過了粳稻日本晴[7,26].當(dāng)KT的質(zhì)量濃度為1.5～2.0 mg/L時，愈傷組織的生長速率最快，與Kommamine等[27]提出的細胞分裂素能提高原胚團的生長速率吻合.從17組培養(yǎng)基(見表1)中，筆者選出最佳誘導(dǎo)激素配比為1.0 mg/L 2,4-D，4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT.

秈稻組培體系中，愈傷組織的分化一直是一道難題.筆者通過正交實驗設(shè)計的方法設(shè)計優(yōu)化了“成恢448”愈傷組織的分化條件，從實驗結(jié)果中可以看出，NAA，KT和6-BA對于愈傷組織的分化率不呈線性關(guān)系，這可能與各激素在分化過程中復(fù)雜的作用機制有關(guān).愈傷組織分化過程中生長素的濃度比誘導(dǎo)過程中的低得多，只在0.25～1.00 mg/L之間，顯然，低濃度的生長素有利于“成恢448”愈傷組織的分化，這和其他植物愈傷組織的分化[28]是相通的.與許多報道相一致的是，KT和6-BA能夠在一定程度上拮抗高濃度2,4-D對愈傷組織分化的抑制作用，有利于水稻愈傷組織的分化[28-30].目前對蜀恢881，IR24和93-11等數(shù)個秈稻品種已報道了不同的再生體系[31-32],雖然針對不同品種其添加的激素濃度不同，但NAA，KT或6-BA不可或缺，可知植物生長素和細胞分裂素對于愈傷組織的再生起到不可忽視的作用.

本文建立了秈稻“成恢448”的組培體系，這一結(jié)果為該強優(yōu)恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定了堅實基礎(chǔ)，同時也為水稻抗白葉枯病基因的克隆與功能研究提供了一個有效的轉(zhuǎn)基因功能驗證受體系統(tǒng).

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