易麗昕，馬海英

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 110032；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110001)

阿司匹林具有抗凝血、抑制血小板活性的作用，小劑量阿司匹林被廣泛用于防治缺血性心腦血管疾病[1]。氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類抗血小板藥，其活性代謝產(chǎn)物有抑制血小板聚集的作用。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期預(yù)防性應(yīng)用氯吡格雷和阿司匹林有益于預(yù)防心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生[2]，但同時(shí)也有增加出血發(fā)生率、減少中性粒細(xì)胞等風(fēng)險(xiǎn)[3]，因此兩藥聯(lián)用時(shí)有必要監(jiān)測(cè)血藥濃度。目前，同時(shí)測(cè)定氯吡格雷和阿司匹林血藥濃度的文獻(xiàn)不多，采用HPLC法測(cè)定操作繁瑣，并且氯吡格雷血藥濃度低，HPLC法測(cè)定尚不夠準(zhǔn)確[4]。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法同時(shí)測(cè)定中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病人阿司匹林和氯吡格雷的血藥濃度，為臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)提供了新方法。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC-10 ATvp液相色譜輸液泵、2010 EV型單重四極桿質(zhì)譜儀(ESI源)、LC-MS Solution 3.0工作站(日本島津公司)；800型臺(tái)式低速離心機(jī)(江蘇省金壇市中大儀器廠)；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；FA1004N萬(wàn)分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品和試劑 阿司匹林、氯吡格雷、苯甲酸的對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100113-201104、100819-201104、100419-201302)；甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸、二氯甲烷(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水為重蒸水(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件 (1)色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸水溶液(60∶40)；柱溫30 ℃；流速0.8 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。(2)質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，接口溫度400 ℃，脫溶劑氣溫度 250 ℃，加熱塊溫度200 ℃，霧化氣(N2)流速2.5 L/min，干燥氣(N2)流速2.0 L/min，檢測(cè)電壓1.5 kV。采用正離子模式檢測(cè)，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)，用于定量分析的離子分別為m/z322.1(氯吡格雷)、m/z178.9(阿司匹林)和m/z121.1(內(nèi)標(biāo)苯甲酸)。

2.2 溶液的配制 (1)對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取氯吡格雷和阿司匹林對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成含氯吡格雷10 μg/ml和阿司匹林250 μg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存，備用。(2)內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取苯甲酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋為50 μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋至濃度為10 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置4 ℃冰箱保存，備用。(3)對(duì)照品系列溶液：精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成阿司匹林濃度分別為0.5、2、10、40、100、250 μg/ml，氯吡格雷濃度分別為0.05、0.2、0.5、2、5、10 μg/ml的對(duì)照品系列溶液，置4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 血漿預(yù)處理 取1 ml待測(cè)血漿，加內(nèi)標(biāo)溶液20 μl、二氯甲烷3 ml，渦旋振蕩3 min，以100.62×g離心10 min。取上清液置另一試管中，于40 ℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲堅(jiān)?00 μl流動(dòng)相溶解后，超聲1 min，渦旋振蕩1 min，以1.509×104×g離心5 min后，取上清液，作為血漿樣品溶液。

2.4 方法專屬性考察 阿司匹林、內(nèi)標(biāo)(苯甲酸)、氯吡格雷經(jīng)離子化(ESI源)，主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，m/z分別為178.9(阿司匹林)、121.1(內(nèi)標(biāo)苯甲酸)和322.1(氯吡格雷)。全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 全掃描質(zhì)譜圖

取空白血漿1 ml，除了不加內(nèi)標(biāo)外，其他按2.3項(xiàng)下操作，得到空白血漿樣品溶液。將一定濃度(含阿司匹林40 μg/ml，氯吡格雷2 μg/ml)的對(duì)照品溶液20 μl和內(nèi)標(biāo)溶液20 μl加入1 ml空白血漿中，按2.3項(xiàng)下操作，得模擬血漿樣品溶液。取病人血漿1 ml，按2.3項(xiàng)下操作，得待測(cè)血漿樣品。把空白血漿樣品、模擬血漿樣品和待測(cè)血漿樣品分別進(jìn)樣測(cè)定，得到色譜圖，見圖2。由圖2可見，阿司匹林、內(nèi)標(biāo)(苯甲酸)和氯吡格雷的保留時(shí)間分別約為 2.0、2.4和3.2 min，空白血漿對(duì)藥物和內(nèi)標(biāo)出峰無(wú)干擾，方法專屬性強(qiáng)。

圖2 血漿樣品的LC-MS譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿1 ml，加入2.2項(xiàng)(3)對(duì)照品系列溶液20 μl，配制成系列濃度分別為阿司匹林10、40、200、800、2000、5000 ng/ml，氯吡格雷1、4、10、40、100、200 ng/ml的模擬血漿樣品。按2.3項(xiàng)方法預(yù)處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以藥物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：阿司匹林Y=0.012 9X+0.030 5(r=0.996 8)，線性范圍10～5000 ng/ml，定量下限10 ng/ml；氯吡格雷Y=0.003 5X+0.000 7(r=0.997 8)，線性范圍1～200 ng/ml，定量下限1 ng/ml。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿1 ml，分別加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，得到低、中、高濃度(阿司匹林40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷4、40、160 ng/ml)的質(zhì)控樣品。每一濃度取5份樣本進(jìn)行分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計(jì)算質(zhì)控樣品中阿司匹林和氯吡格雷的濃度，并計(jì)算RSD，結(jié)果見表1。由表1可見，本方法的日內(nèi)和日間RSD均<15%，符合對(duì)生物樣品的檢測(cè)要求。

表1 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取2.6項(xiàng)低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每一濃度取5份樣本進(jìn)行分析。另取空白血漿1 ml，除了不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按2.3項(xiàng)方法預(yù)處理，向獲得的上清液中加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液20 μl和內(nèi)標(biāo)溶液20 μl，使阿司匹林終濃度為40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷終濃度為4、40、160 ng/ml，按2.3項(xiàng)方法預(yù)處理后進(jìn)樣分析。以提取后的峰面積與未經(jīng)提取測(cè)得的峰面積之比計(jì)算提取回收率，見表1。內(nèi)標(biāo)溶液經(jīng)同樣提取處理，平均提取回收率為(80.1±4.2)%(n=5)。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 考察低、中、高濃度(阿司匹林40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷4、40、160 ng/ml)的質(zhì)控樣品在室溫放置24 h，預(yù)處理后在進(jìn)樣器中放置12 h，經(jīng)過(guò)3個(gè)冷凍-解凍循環(huán)，-20 ℃保存15 d的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD均<15%(n=5)，表明質(zhì)控樣品在上述條件下保存，穩(wěn)定性良好。

2.9 臨床應(yīng)用 選取本院神經(jīng)內(nèi)科2013年1-9月長(zhǎng)期口服阿司匹林片和氯吡格雷片且肝、腎功能正常的病人10例，于清晨空腹采集肘靜脈血，應(yīng)用本研究建立的LC-MS法測(cè)定阿司匹林和氯吡格雷的血藥濃度。測(cè)得阿司匹林血藥濃度為100～900 ng/ml，氯吡格雷血藥濃度為5～30 ng/ml。

3 討 論

作者在研究過(guò)程中考察了沉淀蛋白質(zhì)法和液液萃取法對(duì)血漿樣品的提取效果。采用甲醇、乙腈等試劑對(duì)血漿樣品進(jìn)行沉淀蛋白質(zhì)處理，結(jié)果樣品溶液中雜質(zhì)較多，基質(zhì)對(duì)主藥出峰影響大，故改用液液萃取法進(jìn)行處理。提取溶劑考察了二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯，其中二氯甲烷提取回收率高，干擾小，故最終選用二氯甲烷作為提取溶劑。由于受基因多態(tài)性等因素的影響，阿司匹林和氯吡格雷的體內(nèi)代謝存在廣泛的個(gè)體差異[5,6]，因此在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注重個(gè)體化給藥。目前，多采用HPLC法測(cè)定阿司匹林和氯吡格雷的血漿濃度，缺點(diǎn)是操作繁瑣，并且氯吡格雷血藥濃度較低，應(yīng)用常規(guī)的HPLC法并不能準(zhǔn)確測(cè)定。本研究建立的LC-MS法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，靈敏度高，可同時(shí)測(cè)定阿司匹林和氯吡格雷的濃度，能用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

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