林 峰，周志軍，張晨虹，劉 芳，郭聞淵，魏若菡，陳 慧 (. 臺(tái)州市第一人民醫(yī)院, 浙江 臺(tái)州 3800；. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院器官移植科, 上海 00003)

隨著外科手術(shù)水平的提高、器官保存技術(shù)的發(fā)展以及新型免疫抑制劑的應(yīng)用，器官移植已經(jīng)進(jìn)入了全面、快速發(fā)展的階段，就肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT)而言，其已成為各種終末期肝病唯一、有效的治療手段。然而，仍有一些難題困擾著OLT的快速發(fā)展，移植肝再灌注所激發(fā)的炎癥反應(yīng)就是其中之一。一方面，再灌注后炎癥反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、壞死，加重移植肝功能障礙，甚至造成原發(fā)性供肝無(wú)功能，對(duì)于合并脂肪變性或心臟死亡供體肝而言，這種損害可能更加嚴(yán)重；另一方面，這種炎癥反應(yīng)也會(huì)造成遠(yuǎn)隔器官(如肺、腎)的功能損害。因此，尋求減輕移植肝再灌注后炎癥反應(yīng)的干預(yù)措施或治療藥物，是目前肝臟外科及器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從人尿液中提取、精制的一種糖蛋白水解酶抑制劑，目前已廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎、感染等臨床領(lǐng)域，顯示了良好的抑制全身性炎癥反應(yīng)的作用。然而，烏司他丁對(duì)移植肝再灌注所激發(fā)的炎癥是否有明顯的抑制作用，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本課題擬在建立大鼠同系肝臟移植模型基礎(chǔ)上，研究烏司他丁對(duì)移植肝再灌注后炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 4～6周齡的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200～220 g，購(gòu)于上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，無(wú)特殊病原體環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。烏司他丁購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司(104U/支，生產(chǎn)批號(hào)：03120624)。原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Chemicon International Inc.公司，兔抗大鼠F4/80單克隆抗體及蛋白印跡用抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Crutz公司，大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β 、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2OLT模型、分組及標(biāo)本采集 受體大鼠術(shù)前禁食12 h，自由進(jìn)水，供體大鼠不禁食。SD同系大鼠非動(dòng)脈化OLT模型按照我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完善的方法建立[1]。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：假手術(shù)組、對(duì)照組和烏司他丁組。假手術(shù)組大鼠僅接受麻醉、開(kāi)腹、肝周韌帶游離及關(guān)腹操作；烏司他丁組及對(duì)照組大鼠接受同系原位肝移植，門(mén)靜脈開(kāi)放后，烏司他丁組經(jīng)尾靜脈注射烏司他丁1×104U/kg，對(duì)照組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。再灌注后6 h和24 h每組分別處死4只大鼠，獲取下腔靜脈血標(biāo)本及肝臟標(biāo)本。血標(biāo)本37 ℃恒溫箱靜置2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜后以 2 000 r/min離心10 min, 分離并收集血清，置-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶及細(xì)胞因子；部分肝臟標(biāo)本經(jīng)液氮迅速冰凍后，凍存于-70℃，用于提取核酸或蛋白；另取部分肝臟標(biāo)本用10%甲醛(福馬林)溶液固定用于組織學(xué)檢查，部分肝組織凍存于Tissue Teck保存液內(nèi)用于免疫組化檢測(cè)；各組實(shí)驗(yàn)均完成后，對(duì)標(biāo)本集中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative RT-qPCR) 肝組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA表達(dá)水平采用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)[1]。建立逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系，總量10 μl。所用引物序列如下：TNF- 上游引物：5′-CTT CTC ATT CCT GCT CGT GG T-3′，下游引物：5′-CCT CTG CTT GGT GGT TTG C-3′； IL-1β上游引物：5′-CTT CCT TGT GCA AGT GTC TGA AG C-3′，下游引物：5′-AAG AAG GTG CTT GGG TCC TCA TCG-3′；IL-6上游引物：5′-AGC GAT GAT GCA CTG TCA GA-3′，下游引物：5′-GGT TTG CCG AGT AGA CCT CA-3′； MCP-1上游引物：5′- GAT GCA GTT AAT GCC CCA CT-3′，下游引物：5′- TTC CTT ATT GGG GTC AGC AC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。 PCR條件如下：預(yù)變性，50 ℃ 2 min, 95 ℃ 5 min；PCR循環(huán)(40個(gè))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s。所用儀器為ABI Step OneTM實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR儀(Applied Biosystems, USA)。目的基因 mRNA表達(dá)水平以相應(yīng)標(biāo)本內(nèi)GAPDH mRNA為基準(zhǔn)采用[2△△C(T)]方法計(jì)算[2]，并將假手術(shù)組標(biāo)本內(nèi)目的基因表達(dá)水平設(shè)為1，對(duì)其他組標(biāo)本內(nèi)目的基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算(所得結(jié)果為1的倍數(shù))[1]。

1.4蛋白質(zhì)印跡 用冷裂解液勻漿化肝組織，然后向裂解物內(nèi)加入等體積含十二烷基硫酸鈉(SDS)的蛋白質(zhì)緩沖液，水浴鍋內(nèi)煮沸10 min，于4℃、10 000 r/min離心 10 min，收集上清并采用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(30 μg/泳道)，用轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，常溫下用含5%脫脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline, pH 7.6,含0.05% Tween 20)封閉2 h。經(jīng)TBST清洗2次后，加入適當(dāng)稀釋的第一抗體，4℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育1 h，最后加入底物并曝光、顯影。

1.5ELISA檢測(cè) 再灌注24 h后血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1含量的測(cè)定是采用相應(yīng)的ELISA試劑盒，并按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.7細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)對(duì)肝臟凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。計(jì)數(shù)400×高倍視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每組4只小鼠，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD檢驗(yàn))，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1烏司他丁對(duì)移植肝功能及病理學(xué)損害的影響 再灌注6 h和24 h，血清ALT水平見(jiàn)表1，對(duì)照組ALT水平較假手術(shù)組均明顯升高(P<0.01)，而同時(shí)間點(diǎn)烏司他丁組ALT水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。

表1 再灌注6 h和24 h各組大鼠血清ALT水平及肝組織Suzuki評(píng)分

1)P< 0.01，與假手術(shù)組比較;2)P< 0.01，與對(duì)照組比較

圖1 再灌注24 h各組大鼠肝病理學(xué)變化(H-E：200×)

再灌注24 h，各組小鼠肝病理學(xué)檢查結(jié)果如圖1。假手術(shù)組肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病變；對(duì)照組標(biāo)本肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞漿疏松化，呈氣球樣變性，部分肝細(xì)胞溶解壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝竇內(nèi)見(jiàn)大量紅細(xì)胞瘀積；烏司他丁組標(biāo)本肝細(xì)胞損傷較對(duì)照組明顯減輕，肝組織結(jié)構(gòu)破壞較輕，僅部分肝細(xì)胞腫脹呈氣球樣變。各組肝臟標(biāo)本組織損傷Suzuki評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明烏司他丁可以顯著減輕肝再灌注后肝功能及肝組織害。

2.2烏司他丁對(duì)移植肝細(xì)胞凋亡影響 細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡過(guò)程。各組標(biāo)本肝細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)表2。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組再灌注6及24 h肝細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01)，而同時(shí)間點(diǎn)烏司他丁組肝細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)。

2.3烏司他丁對(duì)移植肝Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 采用免疫組化的方法檢測(cè)肝標(biāo)本內(nèi)F4/80陽(yáng)性Kupffer浸潤(rùn)情況，結(jié)果見(jiàn)表3。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組標(biāo)本Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯增多(P<0.01)，而同時(shí)間點(diǎn)烏司他丁組Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)。

表2 再灌注6 h和24 h各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況

1)P< 0.01，與假手術(shù)組比較；2)P< 0.01，與對(duì)照組比較

表3 再灌注6及24 h各組大鼠肝組織內(nèi)Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)情況

1)P< 0.01，與假手術(shù)組比較；2)P< 0.01，與對(duì)照組比較

2.4烏司他丁對(duì)肝組織內(nèi)炎癥介質(zhì)mRNA表達(dá)的影響 再灌注6 h，各組肝標(biāo)本內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)圖2。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組肝標(biāo)本內(nèi)上述炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而烏司他丁組上述炎癥介質(zhì)mRNA水平顯著降低(P<0.01)。

2.5烏司他丁對(duì)血清內(nèi)炎癥介質(zhì)含量的影響 再灌注24 h，各組大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1含量見(jiàn)表4。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組大鼠血清內(nèi)上述炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而烏司他丁組大鼠血清內(nèi)上述炎癥介質(zhì)含量顯著降低(P<0.01)。

圖2 再灌注6 h肝標(biāo)本內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)MCP-1(pg/ml)假手術(shù)組31.8±8.465.5±15.9104.8±20.924.0±7.1對(duì)照組157.5±22.21) 714.5±132.31) 1443.5±208.51) 454.3±82.61) 烏司他丁組101.8±16.12) 543.8±74.12) 1038.0±162.32) 315.3±47.52)

1)P< 0.01，與假手術(shù)組比較；2)P< 0.01，與對(duì)照組比較

2.6烏司他丁對(duì)肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的影響 再灌注24 h，各組肝標(biāo)本內(nèi)NF-κB活性亞單位P65磷酸化水平見(jiàn)圖3。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組肝組織內(nèi)磷酸化P65表達(dá)水平明顯升高；而烏司他丁組磷酸化P65表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。半定量灰度分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 再灌注24 h各組肝標(biāo)本內(nèi)P65磷酸化水平

圖4 半定量分析各組肝標(biāo)本內(nèi)P65磷酸化水平

3 討論

肝缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷常于肝外科手術(shù)如肝部分切除術(shù)、肝移植術(shù)以及創(chuàng)傷、休克的治療過(guò)程發(fā)生，往往具有較高的發(fā)病率及病死率，是困擾臨床醫(yī)生的重要難題之一[4]。近年來(lái)，大量的研究顯示，以固有免疫為主的炎癥反應(yīng)包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性介質(zhì)表達(dá)以及炎性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化等在肝缺血再灌注損傷尤其是移植肝缺血再灌注損傷中具有重要的致病作用[5,6]。因此，靶向抑制移植肝再灌注后的炎癥反應(yīng)是減輕移植肝缺血再灌注損傷的重要途徑之一。

烏司他丁又名尿抑制素，是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)糖蛋白，由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為67 ku[7]。臨床研究顯示，烏司他丁對(duì)急性胰腺炎、重癥感染等全身性炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，其機(jī)制包括抑制中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶、組織蛋白酶，并抑制中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子，清除氧自由基，穩(wěn)定溶酶體膜，減少溶酶體膜破裂釋放造成的組織損傷等[8-10]。本課題中我們首先研究了烏司他丁對(duì)移植肝缺血再灌注損傷的影響，結(jié)果顯示烏司他丁可以減輕肝再灌注損傷，表現(xiàn)為降低血清ALT等生化酶水平，減輕移植肝組織病理學(xué)損害程度并減輕肝細(xì)胞凋亡。

鑒于炎癥反應(yīng)在移植肝缺血再灌注損傷中的核心作用，筆者研究了烏司他丁對(duì)肝再灌注后炎癥反

應(yīng)的影響。已有研究顯示，Kupffer細(xì)胞在肝缺血再灌注所激發(fā)的炎癥反應(yīng)中具有重要意義[11]。既往的研究也顯示，再灌注時(shí)Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)至肝激發(fā)并加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織損傷，而抑制Kupffer細(xì)胞功能減輕肝缺血再灌注損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏司他丁對(duì)肝再灌注后Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)有明顯的抑制作用。Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生并加重肝缺血再灌注損傷與下列機(jī)制有關(guān)。再灌注初始階段，Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)變化并突入肝竇內(nèi)，因而阻礙竇腔內(nèi)血流加重微循環(huán)障礙[13]；Kupffer細(xì)胞活化后釋放大量炎性介質(zhì)如ROS、IL-6、TNF-α等，一方面炎性介質(zhì)可以直接造成組織損傷，另一方面，炎性介質(zhì)可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向損傷部位浸潤(rùn)[14]。

TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中非常重要的炎癥介質(zhì)，可由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放，能夠激發(fā)并加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重肝缺血再灌注損傷[15]。烏司他丁能夠明顯抑制肝再灌注后上述炎癥介質(zhì)的表達(dá)。這些炎癥介質(zhì)導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制主要包括：直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、壞死；促進(jìn)肝竇內(nèi)形成微血栓，造成血運(yùn)障礙；進(jìn)一步放大炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)；促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向損傷部位聚集，加重炎癥反應(yīng)及組織損傷。最后，檢測(cè)了烏司他丁對(duì)肝再灌注后組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的影響。NF-κB主要P65和P55兩個(gè)亞單位組成，P65是其活性亞單位，NF-κB活化時(shí)P65發(fā)生磷酸化并與P55分離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏司他丁能夠明顯抑制NF-κB活化，這一機(jī)制可以部分解釋烏司他丁抑制移植肝再灌注后TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1表達(dá)的作用。

綜上所述，本研究表明烏司他丁對(duì)移植肝再灌注損傷有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與抑制再灌注后炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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