鐘涵宇，張一凱，張敬一，李 科 (.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，上海 00433，.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 006)

近年來，腦血栓、心肌梗死、外周動(dòng)脈血栓、深靜脈血栓等一系列血栓栓塞疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，其發(fā)病率、致殘率和致死率都居各類疾病之首，成為危害人類健康的頭號殺手，而大多數(shù)心腦血管疾病都與凝血異常所導(dǎo)致的血栓和血栓栓塞有著密切的聯(lián)系[1,2]。血小板在止血、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等過程中起著重要作用，因此阻止血小板凝聚就可以達(dá)到抗凝的目的。抗血小板治療是通過藥物阻滯血小板聚集而起到預(yù)防血栓形成，減少缺血性卒死事件的發(fā)生；同時(shí)也是缺血性卒死一級和二級預(yù)防的重要組成部分[3,4]。

木脂素類化合物具有多種結(jié)構(gòu)類型，體外活性測試表明，該類型的化合物體外具有抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、松弛平滑肌、抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)活性[5]。本課題組首次以2-(4-甲氧基苯基)-4-乙烯基-2,5-二氫呋喃為母核，對該類木脂素化合物進(jìn)行抗凝血活性研究，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了結(jié)構(gòu)為2-(4-甲氧基苯基)-4-乙烯基-2,5-二氫呋喃-3-羧酸的前體化合物，并在其3位側(cè)鏈引入不同的雜環(huán)基團(tuán)共設(shè)計(jì)合成了17個(gè)新目標(biāo)化合物，并對所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行抑制血小板凝集的抗凝血活性測試。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器及材料 RY-2型熔點(diǎn)儀，溫度未經(jīng)過校正；核磁共振氫譜用Bruker Spectmspin AC-P300型核磁共振測定，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)；對照品MCI-154[6]由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)教研室合成；合成過程中所用原料及試劑均為市售分析純。

1.22-(4-甲氧基苯基)-4-乙烯基-2,5-二氫呋喃-3-羧酸的合成 見圖1。

圖1 中間體V的合成方法

1.2.1芳基次甲基丙二酸二乙酯(Ⅲ)的合成 將60.75 ml對甲氧基苯甲醛、90 ml丙二酸二乙酯及15 ml冰乙酸、6 ml哌啶加入500 ml無水甲苯中，加熱至回流，用分水器分出反應(yīng)過程中生成的水。9 h后終止反應(yīng)，減壓蒸去甲苯，油泵蒸去丙二酸二乙酯得油狀粗產(chǎn)品。在粗產(chǎn)品中加乙醇50 ml于冰箱中冰凍結(jié)晶，得到白色固體Ⅲ (129.6 g, 收率80%),mp: 145.1～145.5 ℃。

1.2.24-乙烯基-2-對甲氧基苯基-2,5-二氫呋喃-3-羧酸(Ⅴ)的合成 在冰浴條件下，將NaH (17.28 g，0.72 mol)加入100 ml的無水的THF中，攪拌30 min后將1,4丁炔二醇(23.24 g，0.27mol)溶解于60 ml無水THF中，用恒壓滴液漏斗滴入上述NaH的無水THF中，劇烈攪拌；將芳基次甲基丙二酸二乙酯(Ⅲ)用100 ml無水THF溶解，緩慢滴入反應(yīng)液中，繼而將研細(xì)的CuI一次加入到反應(yīng)瓶中。將反應(yīng)燒瓶油浴加熱至40 ℃，恒溫下攪拌6 h。用TLC監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束，向反應(yīng)液中緩慢加入100 ml水，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3。減壓回收THF，用100 ml二氯甲烷反復(fù)萃取3次，合并二氯甲烷相，用MgSO4干燥后進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以PE:EA = 10:1洗脫，得關(guān)鍵中間體Ⅴ。

1.3目標(biāo)化合物的合成

1.3.1苯胺、芐胺及苯乙胺類衍生物的合成(圖2) 將2-(4-甲氧基苯基)-4-乙烯基-2,5-二氫呋喃-3-羧酸(0.5 g，1.89 mmol)加入5 ml無水CH2Cl2中，加入1 ml的SOCl2。加熱回流4 h，減壓蒸去溶劑，用少量無水CH2Cl2除去過量SOCl2，得到固體粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物加入10 ml的無水CH2Cl2中，將溶液置于冰鹽浴中使反應(yīng)瓶溫度降低至0 ℃以下，向CH2Cl2溶液中緩慢加入1.1倍量芐胺(2.12 mmol)和1 ml吡啶，攪拌3 h后撤去冰鹽浴常溫?cái)嚢柽^夜。加入3 ml冰乙酸終止反應(yīng)，濃縮反應(yīng)液后倒入冰水中，有固體析出，過濾，洗滌，干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

圖2 苯胺，芐胺，苯乙胺衍生物系列的合成

1.3.2哌嗪類衍生物的合成(圖3) 將2-(4-甲氧基苯基)-4-乙烯基-2,5-二氫呋喃-3-羧酸(0.2 g，0.5 mmol)加入到5 ml無水CH2Cl2中，攪拌，加入1ml的SOCl2，加熱回流4 h，減壓蒸去溶劑，用少量無水CH2Cl2除去過量SOCl2，得到固體粗產(chǎn)物。將此固體加入10 ml的無水CH2Cl2中，將溶液置于冰鹽浴中使反應(yīng)瓶溫度降低至0℃以下，向CH2Cl2溶液中緩慢加入1.5倍量2,3-二氯苯基哌嗪和NaH (0.2 g，8.3 mmol)，攪拌3 h后撤去冰浴常溫?cái)嚢柽^夜。加入3 ml冰乙酸終止反應(yīng)，濃縮反應(yīng)液后倒入冰水中，有固體析出，過濾，洗滌，干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

圖3 哌啶衍生物系列的合成

1.3.3其他目標(biāo)化合物均按以上方法合成 17個(gè)目標(biāo)化合物經(jīng)光譜確證結(jié)構(gòu)，其數(shù)據(jù)見表1。

表1 合成目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)，理化常數(shù)及氫譜數(shù)據(jù)

續(xù)表1

2 藥理實(shí)驗(yàn)

參考Born比濁法，測定所有目標(biāo)化合物對ADP誘導(dǎo)的新西蘭大白兔血小板凝集活性，以MCI-154(由本教研室合成)為陽性對照物，MCI-154, [6-]4-(4-吡啶氨基)苯基]-4,5-二氫-3(2H)噠嗪酮], 是一種新型強(qiáng)心劑, 它能通過增加心臟對Ca2+的敏感性來促進(jìn)心臟收縮功能[7,8]。取新西蘭大白兔心臟血，離心制備富含血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。接通聚集儀電源，使之預(yù)熱30 min，恒溫(37±0.1)℃，取2只比色杯，一只加入PPP 200 ml，另一只加入PRP 200 ml，置聚集儀中預(yù)熱5 min，分別向兩杯中加入空白溶劑DMSO 1 ml，用PPP杯調(diào)節(jié)透光率為100%，用PRP杯調(diào)節(jié)透光率為0。于裝有PRP杯中加入配制好的不同濃度的ADP溶液，攪拌下觀察3 min血小板的最大聚集程度，從而得出誘導(dǎo)劑的閾劑量，將目標(biāo)化合物配成不同濃度的DMSO溶液，加入含200 LPRP的比色管中，同上條件觀察血小板的最大聚集程度，計(jì)算血小板聚集的抑制百分率，并用回歸法求出各目標(biāo)化合物的50%抑制活性。體外抑制血小板聚集的活性數(shù)據(jù)見表2。

聚集抑制率 = (對照聚集率-樣品聚集率)

/對照聚集率×100%

表2 化合物2～10抗血小板聚集活性

3 結(jié)果與討論

經(jīng)初步的體外抗血小板凝集實(shí)驗(yàn)表明，所合成的目標(biāo)化合物對ADP引起的血小板聚集有不同程度的抑制作用。其中大部分化合物的活性均優(yōu)于對照藥MCI-154，化合物3， 6和 10的IC50值分別為0.63，1.09和1.62μmol/L，分別是對照藥的22.2, 12.8 和 8.6倍。從上面的藥理活性數(shù)據(jù)來看，R基團(tuán)的引入對抗血小板凝集有一定的影響，其中取代芐胺的引入可以增強(qiáng)其血小板聚集的抑制作用，特別是對位為F取代的化合物對藥效提高有幫助，而供電子的引入會(huì)降低抗血小板凝聚作用。對于雜化和苯乙胺的引入對于藥效影響不顯著。但由于目標(biāo)化合物的數(shù)目有限，尚難得出全面的構(gòu)效關(guān)系討論，有待于進(jìn)一步的研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 楊曦明, 范 聰, 李慧萍, 等. 白樹花多糖硫酸酯的抗凝血活性研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2010, 14 (7): 1031.

[2] Gardell SJ, Sanderson PE. Novel anticoagulants based on direct inhibition of thrombin and factor Xa[J]. Coron Artery Dis, 1998, 9 (2-3): 75.

[3] 趙東明, 劉超美. 6-取代乙酰哌嗪苯基二氫噠嗪酮類化合物的合成及其抑制血小板聚集的作用[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24 (5): 510．

[4] 覃 軍, 王祥志, 劉毅敏. 6-(4-取代苯基)-5-甲基-4,5-二氫-3(2H)噠嗪酮類化合物的合成及其抑制血小板聚集的作用[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2006, 18 (9): 1088．

[5] 周大錚, 易楊華, 毛士龍, 等. 香榧假種皮中的木脂素成分[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 39 (4): 269.

[6] Yang GM, Liu LM, Xu J. Effects of MCI-154 on vascular reactivity and its mechanisms after hemorrhagic shock in rats[J]. J Cardiov, 2006, 47 (6): 751.

[7] Kitada Y, Narimatsu A, Matsumura N,etal. Increase in Ca2+sensitivity of the contractile system by MCI-154, a novel cardiotonic agent, in chemically skinned fibers from the guinea pig papillary muscles[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1987, 243 (2): 633.

[8] Okafor C, Liao R, Perreault-Micale C,etal. Mg2+-ATPase and Ca2+activated myosin ATPase activity in ventricular myofibrils from non-failing and diseased human hearts-effects of calcium sensitizing agents MCI-154, DPI 201-106, and caffeine[J]. Mol Cell Biochem, 2003, 245 (1-2): 77.