林 珊，蘇 娟，葉 霽，曹邦靜，張衛(wèi)東 (.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 5008；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；.江西中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 0004)

核磁共振技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥成分的結(jié)構(gòu)解析，基于核磁共振的定量分析方法——定量核磁共振(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)技術(shù)作為一種日益成熟的儀器分析方法，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性高的特點(diǎn)，與其他分析方法相比，具有以下優(yōu)勢(shì)[1]：核質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度與數(shù)目成正比，與化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，適用于多數(shù)化合物；利用內(nèi)標(biāo)法或相對(duì)測(cè)量法，定量時(shí)無須該化合物的純品作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)；信號(hào)峰的寬度窄，遠(yuǎn)小于各信號(hào)之間的化學(xué)位移的差值，不同組分的信號(hào)之間很少發(fā)生重疊；不破壞被測(cè)樣品。因此，qNMR是一種用于中藥分析的重要方法。

本文綜述了qNMR技術(shù)的原理、方法及其近10年來在中藥分析中的應(yīng)用。

1 qNMR原理

從一張核磁共振圖譜中，可以得到下列重要數(shù)據(jù)：化學(xué)位移、偶合常數(shù)和共振峰面積?；瘜W(xué)位移和偶合常數(shù)是結(jié)構(gòu)測(cè)定的重要參數(shù)，而共振峰面積(或峰高)則是定量分析的重要參數(shù)。在核磁共振技術(shù)(NMR)中，共振峰面積或峰高與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比，這是定量的依據(jù)。

NMR定量分析是通過比較特定的吸收峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)的，只要樣品中每個(gè)組分有1個(gè)或1組互不重疊的特征吸收峰，都有可能用NMR波譜法進(jìn)行定量分析，但選定進(jìn)行定量積分的信號(hào)歸屬必須是已知的[2]。NMR波譜用于定量分析的基礎(chǔ)是各化學(xué)環(huán)境不同的粒子吸收峰面積只與所包含的粒子數(shù)有關(guān)[3]。故不需引進(jìn)任何校正因子或繪制工作曲線，就可直接根據(jù)各共振峰的積分值推算所代表的自旋核數(shù)量[4-5]。目前主要采用的定量方法有：

1.1內(nèi)標(biāo)法 又稱絕對(duì)測(cè)量法[6]，是NMR定量分析中最常用的方法。至少需要知道被測(cè)物的分子量、選定進(jìn)行定量積分的信號(hào)及產(chǎn)生該信號(hào)的質(zhì)子數(shù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在樣品溶液中直接加入一定量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)后，進(jìn)行NMR波譜測(cè)定。樣品的絕對(duì)質(zhì)量Ws可由(1)式求得：

(1)

其中，As為被測(cè)樣品定量峰的積分面積，ns為被測(cè)樣品定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Ms為被測(cè)樣品的分子質(zhì)量，Ar為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)定量峰的積分面積，nr為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Mr為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，mr為稱取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，Wr為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量百分含量，ms為樣品質(zhì)量。

此方法中內(nèi)標(biāo)的作用不同于常規(guī)分析方法。常規(guī)分析方法中，內(nèi)標(biāo)的作用是減少操作誤差，而此方法中，內(nèi)標(biāo)是定量的依據(jù)。內(nèi)標(biāo)的選擇考慮以下4個(gè)方面：①最好產(chǎn)生單一共振峰，在掃描磁場(chǎng)區(qū)域中，內(nèi)標(biāo)共振峰和樣品共振峰的位置至少有30 Hz的間隔；②能溶于分析溶劑；③有盡可能小的質(zhì)子摩爾(質(zhì)子摩爾=樣品的分子量/產(chǎn)生該共振峰的基團(tuán)中的質(zhì)子數(shù))；④不應(yīng)與樣品中任何組分發(fā)生相互作用。

常用內(nèi)標(biāo)有硅烷類[如四甲基硅烷(TMS)、3-(三甲基硅基)丙酸鈉-2,2,3,3-D4 (TSP)]、芳環(huán)類(如1,4-二硝基苯、香豆素、苯甲酸)、簡(jiǎn)單烷烴類(如3,4-二硝基甲苯、苯甲酸芐酯、馬來酸)以及其他化合物(如L-亮氨酸、異煙酰胺、咖啡因)。

1.2外標(biāo)法[7]將某組分的標(biāo)準(zhǔn)品制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行NMR測(cè)定。以所得圖譜中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積對(duì)濃度作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在平行條件下測(cè)得樣品溶液中該指定基團(tuán)上質(zhì)子的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得樣品溶液濃度。

1.3相對(duì)測(cè)量法 當(dāng)不能獲得樣品純品或者合適的內(nèi)標(biāo)時(shí)，可選用此法。此方法適用于含有1～2種雜質(zhì)的樣品分析。先計(jì)算出樣品指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A1/n1)和雜質(zhì)指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A2/n2)，再按(2)式計(jì)算樣品的相對(duì)百分含量：

(2)

2 qMNR技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用進(jìn)展

中藥成分的復(fù)雜性受品種、產(chǎn)地、栽培、生長(zhǎng)環(huán)境和采收季節(jié)等多種因素的影響。目前，用于中藥成分分析最常用的方法是高效液相色譜法(HPLC)。但HPLC法有以下不足：分析時(shí)間長(zhǎng)、分離效率低；因色譜柱被污染造成色譜柱使用壽命縮短；色譜柱上沉積的污染物，常以雜質(zhì)峰的形式出現(xiàn)；對(duì)于含極性成分較多的中藥，其“指紋”的特征不強(qiáng)。近年來，國(guó)、內(nèi)外研究者在嘗試采用其他方法進(jìn)行中藥材分析研究，qNMR技術(shù)已成為中藥質(zhì)量控制、中藥活性成分體內(nèi)定量分析等的重要方法之一。

2.1純度分析 李建發(fā)[8]以吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物，采用qNMR法對(duì)葛根素(1)標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取葛根素樣品以及內(nèi)標(biāo)物吡嗪的量，兩者比值約為12，加入氘代二甲基亞砜(DMSO)溶解樣品并定容。分別取約0.5 ml配制好的樣品溶液加入核磁管中，放入核磁磁體中，采集1H-NMR峰譜圖，見圖1。各峰面積截取值見表1。吡嗪特征峰的化學(xué)位移是δ=8.664，面積積分值設(shè)定為1。C7-H、C4-H、C11,15-H、C3-H、C12,14-H峰面積積分值分別記為A1、A2、A3、A4、A5。根據(jù)公式(1)計(jì)算的葛根素含量分別為C1、C2、C3、C4、C5，見表2。根據(jù)表2，C1和C2的5次值的平均值比較接近葛根素樣品的真實(shí)含量96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<1%。因此，應(yīng)以C7-H或C4-H的峰面積積分值計(jì)算葛根素的含量。同樣，李建發(fā)[9]也采用該方法測(cè)定了橙皮苷(2)標(biāo)準(zhǔn)品的含量。

表1 吡嗪峰與葛根素特征峰面積截取值

圖1 吡嗪峰與葛根素特征峰譜圖

表2葛根素百分含量計(jì)算結(jié)果(%)

實(shí)驗(yàn)次數(shù)C1C2C3C4C5195.7195.9496.5496.6096.81296.4096.4997.1198.4597.45396.4596.5997.8398.4597.45496.7096.3997.7795.7598.46595.0095.1895.9095.6995.46平均值96.0596.1297.0397.1997.13RSD(%)0.720.600.851.261.14

Jaki等[10]采用qNMR法測(cè)定具有抗結(jié)核作用的熊果酸純度，并在此基礎(chǔ)上提出了基于天然藥物純度與活性關(guān)系的純度-藥效關(guān)系(PARs)理論。薛松等[11]采用qNMR法確定繁茂膜海綿中分離得到的結(jié)構(gòu)類似的類固醇化合物純度，這種方法為鑒定分析組成復(fù)雜而性質(zhì)相近的天然類固醇化合物提供了新思路。

2.2中藥鑒定 中藥材由于其生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)、加工方法和貯存條件不同，其所含化學(xué)成分、質(zhì)量以及臨床療效也有很大差異。qNMR技術(shù)在鑒定中藥品種和基源等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Gang等[12]采用qNMR法測(cè)定不同品種的黃連，如黃連CoptischinensisFranch、三角葉黃連Coptisdeltoidea(C. Y. Cheng et al)Hsiao和云連CoptisteetaWall中6種原小檗堿類生物堿含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除云連不含表小檗堿外，其他黃連樣品中幾乎都含6種生物堿，所有樣品中小檗堿含量最高。6種生物堿的含量分別是：小檗堿(3)30.27～90.40 mg/g，巴馬丁(4)3.77～23.62 mg/g，表小檗堿(5)含量(0～15.96 mg/g)，古倫樸根堿(6)3.59～9.73 mg/g，黃連堿(7)8.95～29.01 mg/g，非洲防己堿(8)1.04～6.20 mg/g。結(jié)果表明，不同基源的黃連中，6種原小檗堿類生物堿含量差異甚大。Kang[13]采用qNMR法分析植物代謝產(chǎn)物以區(qū)分中國(guó)和韓國(guó)兩產(chǎn)地的人參根粉末。同時(shí)，He[14]用qNMR法分析靈芝(Ganodermalucidum)代謝產(chǎn)物，從而鑒定中國(guó)產(chǎn)和韓國(guó)產(chǎn)的靈芝。

江洪波等[15]采用qNMR技術(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)麥門冬為參照，測(cè)定產(chǎn)地為綿陽的優(yōu)質(zhì)新麥門冬、陳年麥門冬、硫熏麥門冬等中的主要化學(xué)成分含量。結(jié)果表明，不同品種、不同產(chǎn)地、不同年份、不同炮制方法得到的麥門冬，其化學(xué)成分的種類和相對(duì)含量存在明顯差異。

2.3中藥活性成分的含量測(cè)定 中藥的藥效往往是多種活性成分共同作用的結(jié)果，確定其各活性成分的含量是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的前提。近年來，qNMR技術(shù)迅速發(fā)展為測(cè)定中藥活性成分含量開辟了一條新道路。

Li等[16]采用qNMR法快速測(cè)定中藥黃柏(關(guān)黃柏Phellodendronamurense，川黃柏Phellodendronchinense)及其復(fù)方制劑中原小檗堿類生物堿——小檗堿(3)和巴馬丁(4)的含量。結(jié)果顯示，在δ=8.6～8.9的范圍內(nèi)，小檗堿和巴馬丁的H-13信號(hào)與甲醇-d4信號(hào)完全分離。關(guān)黃柏中小檗堿和巴馬丁的回收率范圍在95%～106%，檢測(cè)限和定量限分別是1.0μg/ml和1.8μg/ml。4家公司生產(chǎn)的中藥復(fù)方中，小檗堿的含量不同且均不含巴馬丁。此外，Li等[17]分別采用qNMR法和HPLC法測(cè)定喜樹根中喜樹堿及其衍生物的含量，2種方法的相關(guān)系數(shù)均>0.999。采用qNMR法時(shí)，在δ=5.5～9.5范圍內(nèi)，葫蘆巴堿(9)的H-2信號(hào)、喜樹堿(10)的H-7信號(hào)、9-甲氧基喜樹堿(11)的H-10信號(hào)和短小蛇根草苷(12)的H-19信號(hào)完全分離。4種化合物的回收率分別是：葫蘆巴堿(97.1±1.2)%、喜樹堿(98.4±2.8)%、9-甲氧基喜樹堿(97.3±3.1)%、短小蛇根草苷(96.8±2.5)%(圖 2)。與HPLC法相比，qNMR法在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)無須標(biāo)準(zhǔn)品，可用粗提物直接定量。

二萜類化合物穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮抗炎、抗病毒作用的主要成分。Yang等[18]采用qNMR技術(shù)測(cè)定3種中藥制劑的二萜類含量。脫水穿心蓮內(nèi)酯(13)是3種穿心蓮制劑的主要化合物，穿心蓮內(nèi)酯在消炎利膽片和婦科千金片中未被檢測(cè)到。Liu等[19]采用qNMR法比較不同產(chǎn)地的黃花蒿樣品，并與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)和薄層色譜法(TLC)的結(jié)果相比較。結(jié)果顯示，qNMR法與HPLC-ELSD法的結(jié)果幾乎一致，與LC-MS法的結(jié)果較接近，與TLC法的結(jié)果差異在-0.5 ～3.2 mg/g范圍內(nèi)。該研究證明qNMR法可準(zhǔn)確用于定量黃花蒿樣品。

2.4中藥活性成分體內(nèi)定量分析 在進(jìn)行中藥活性成分體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和有效性研究時(shí)，需要測(cè)定生物樣品中的中藥活性成分或其代謝物的含量，生物樣品中原形藥物及其代謝物濃度通常很低，而且存在內(nèi)源性干擾物。目前，體內(nèi)原形藥物及代謝物分析常采用LC-MS法，它只能對(duì)結(jié)構(gòu)相近的代謝物提供有限的結(jié)構(gòu)信息[20]；而qNMR法具有簡(jiǎn)便性、高分辨率和多目標(biāo)性，且不破壞化合物結(jié)構(gòu)，可提供比LC-MS法更多的結(jié)構(gòu)信息[21]。

Moazzami等[22]采用qNMR法測(cè)定芝麻脂素在人體內(nèi)的代謝物——兒茶酚的含量。6名受試者口服芝麻脂素后采集尿樣，在尿樣中加入β-葡糖苷酸酶及硫酸酯酶，以氯仿提取，以芝麻脂素代謝物中δ=5.91的單峰為定量峰，對(duì)提取液中的兒茶酚進(jìn)行qNMR法測(cè)定。對(duì)于待測(cè)組分含量極低的生物樣品，可先對(duì)樣品在體外溫孵，使其中的藥物代謝繼續(xù)進(jìn)行，直至其代謝物(待測(cè)組分)含量達(dá)到微克水平，然后通過固相萃取(SPE)法或色譜法從溫孵產(chǎn)物中分離、富集足量的待測(cè)組分，最后應(yīng)用qNMR法測(cè)定。

圖2 13種中藥成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)語

qNMR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：分析快速、樣品制備方法簡(jiǎn)單、無須高純標(biāo)準(zhǔn)品，且雜質(zhì)干擾少，無須分離精密度就能滿足要求；在體內(nèi)定量分析中，操作簡(jiǎn)便、分辨率高且具有多目標(biāo)性。然而，qNMR技術(shù)還存在著分析成本高、靈敏度低等問題。研究人員通過不斷嘗試，已提出一些改進(jìn)方案。作者相信隨著qNMR技術(shù)在中藥分析領(lǐng)域應(yīng)用的不斷深入，一定能為中藥分析開拓新思路和新方法。

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