劉佃花， 張恩暉， 劉 沖，范博士， 蔡國君 (第二軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海 200433)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以血管內(nèi)膜瘤、粥樣化或纖維斑塊形成為病變特征的動脈疾病。動脈粥樣硬化的形成過程包括內(nèi)膜的損傷、血管平滑肌細胞的遷移及動脈粥樣斑塊的形成[1]。煙堿(尼古丁)是香煙的一種主要成分，并且為一種選擇性的膽堿能激動劑，能直接促進血管平滑肌細胞的遷移和新生血管形成。流行病學顯示，吸煙可以促進AS的發(fā)生，煙堿可與細胞表面的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)高度結合并加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。本文綜述nAChR在煙堿促動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用，并探討涉及的信號通路。最后，將總結nAChR作為AS治療靶點的可行性。

1 AS發(fā)病機制及流行病學研究

AS起始于血管內(nèi)皮細胞的損傷，并伴隨氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)在血管內(nèi)的積聚，這會引發(fā)單核細胞向內(nèi)膜遷移，巨噬細胞無限制地吞噬過多的 Ox-LDL 后就會變成泡沫細胞。隨著泡沫細胞的增多，動脈粥樣硬化粥樣斑塊的最初形式——脂質(zhì)條紋出現(xiàn)了。另一方面，被激活的內(nèi)皮細胞和單核-巨噬細胞均可分泌多種細胞因子、黏附因子、趨化因子等，這些因子進一步激活平滑肌細胞使之合成細胞外基質(zhì)，引起平滑肌細胞的遷移和增殖。這種過程反復進行，最終形成動脈粥樣硬化斑塊[2]。

流行病學顯示,吸煙對于動脈粥樣硬化、中風以及心肌梗死的發(fā)展有重要影響。香煙中的煙堿可以促進動脈粥樣硬化[3]。最近的研究顯示，煙堿可以與nAChR高度結合，進而影響心血管系統(tǒng)相關的多種細胞，如平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞等的功能(表1)。

表1 nAChR各亞單位在血管組織中的表達[4]

2 nAChR簡介

能與ACh結合的受體，稱為乙酰膽堿受體。其又分為毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M膽堿受體)和煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)。nAChR根據(jù)其分布部位不同可分為神經(jīng)肌肉接頭N受體、神經(jīng)節(jié)N受體和中樞N受體。

N受體屬于配體門控離子通道型受體，不同部位N受體的分子結構十分相似，由亞基α 1～10、β 1～4、γ、δ 以及 ε組成(圖1)[6]。每個N受體由兩個α亞基和β、γ、δ亞基組成五聚體，以形成中間帶孔跨膜細胞膜通道，即N受體離子通道。當ACh與受體上的作用位點結合后，可使離子通道開放，從而調(diào)節(jié)Na+、K+、Ca2+離子流動。帶電荷的氨基酸在中心區(qū)域排列并選擇性地使離子通過通道。人巨噬細胞上N受體第一次被證實存在是應用了可以與N受體特定部位的結合FITC標記的α-銀環(huán)蛇毒素。nAChR在血管中的表達見表1, nAChR各亞基是由Western印跡, RT-PCR 以及 ELISA所分析確定[6]。

3 nAChR研究的來源——煙堿的致動脈粥樣硬化作用

3.1體外實驗 內(nèi)皮細胞損傷，血管平滑肌細胞增殖與遷移在動脈粥樣硬化斑塊的形成，以及冠狀血管成形術后的再狹窄中起重要作用。許多研究顯示，nAChR的配體如煙堿，對各個過程都有作用。Santanam等的研究表明，與對照組相比，100 nmol/L的煙堿可使原代血管平滑肌細胞的遷移增加2倍。胞外基質(zhì)蛋白(如纖維蛋白)可以加強這種遷移。另外，煙堿可以阻止由于饑餓導致的血管平滑肌細胞的凋亡?？傊?，這些研究表明，煙堿可以通過兩種途徑增加血管平滑肌細胞的生長和遷移：增強血管平滑肌細胞的遷移同時抑制凋亡[7]。

3.2體內(nèi)實驗 Strohschneider等首次在動物模型上證明煙堿會導致動脈粥樣硬化[8]，他們觀察到注射煙堿和膽固醇可增加兔主動脈中斑塊的面積。Santanam的實驗室最近研究了煙堿對ApoE-/-小鼠模型斑塊發(fā)展的影響。對雌性ApoE-/-小鼠進行高脂飲食，對照組正常飲水，實驗組飲水中含有200 μg/ml的煙堿。12周后，實驗組的斑塊面積是對照組的近2.6倍，該研究表明，煙堿可能在動脈粥樣硬化早期有致動脈粥樣硬化作用。

血管新生(angiogenesis)是指原有微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等過程產(chǎn)生新血管的過程。血管斑塊中新生血管是指毛細血管在動脈粥樣硬化斑塊中由動脈外膜延展向內(nèi)膜形成的網(wǎng)絡結構。在動脈粥樣硬化的早期，煙堿可增加動脈粥樣的斑塊面積。Heeschen等[9]的前期研究表明：在ApoE-/-小鼠模型中，煙堿對于早期斑塊的新生血管形成有作用。首先，對ApoE-/-小鼠進行20周的高脂飼養(yǎng)，造成動脈粥樣硬化模型。然后隨機分為兩組，對照組正常飲水，實驗組在飲用水中加入煙堿，實驗周期20周。結果表明：與對照組相比，煙堿組的斑塊面積及斑塊中新生血管數(shù)均明顯增加。Lau等[10]的研究也表明：在低密度脂蛋白敲除LDLR-/-鼠中應用煙堿的實驗中，實驗組比對照組的主動脈斑塊面積增加2倍，這與在ApoE-/-模型中的結果相近。

GWAS相關研究證實，在歐洲家族15號染色體(15q24/15q25.1)的長臂中,nAChR基因群存在差異，這些差異可能與外周血管疾病及肺癌的發(fā)生有一定關聯(lián)。更有趣的是，在這區(qū)間的基因是與煙堿成癮性相關的a3-nAChR, a5-nAChR 以及β4-nAChR[11]。流行病學證據(jù)揭示了心血管疾病與吸煙之間有一定的關聯(lián)性，那么上述研究提供了煙草中的煙堿和心血管疾病有關的基因證據(jù)。

煙堿可以與nAChR高度結合，因而在心血管系統(tǒng)的多種細胞上發(fā)揮直接作用。因此，nAChR亞基的信號通路在相關細胞(如血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、血小板及免疫細胞)中對動脈粥樣硬化的作用受到研究者的關注。

4 nAChR的致AS信號通路

血管平滑肌細胞在煙堿導致的心血管疾病中起重要作用[12]。為了研究煙堿對平滑肌細胞產(chǎn)生何種不良影響，將平滑肌細胞分為對照組、煙堿組、煙堿加α-銀環(huán)蛇毒素組、煙堿加PDTC組(α-銀環(huán)蛇毒素為α7-nAChR受體拮抗劑，PDTC為NF-κB抑制劑)，再檢測各組平滑肌細胞信號通路NF-κB的激活及細胞黏附分子的表達。結果顯示煙堿可導致平滑肌細胞中IKK及 IκB的磷酸化、促進NF-κB向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位、上調(diào)4種平滑肌細胞的骨架蛋白，即β-肌動蛋白、γ-肌動蛋白、原肌動蛋白4 和F-肌動蛋白帽蛋白(β-actin, γ-actin, tropomyosin 4 and F-actin capping protein)及增強其細胞遷移能力；用α7受體阻斷劑或NF-κB抑制劑可以阻斷這些效果。概括而言，即煙堿可以通過平滑肌細胞上的α7-nAChR受體使NF-κB信號通路活化，進而使平滑肌細胞骨架蛋白上調(diào)并增強其細胞遷移能力。也有研究報道還存在其他信號通路，像MAPK、ERK等。

應用RPPM反相蛋白芯片(reverse phase protein microarrays)研究內(nèi)皮細胞中nAChR所介導的通路[13]，RPPM可以同時測量多個信號蛋白分子的磷酸化狀態(tài)。Wu等[14]在實驗中選取了與增殖遷移相關的有代表性的磷酸化蛋白進行研究，用α7nAChR和α9nAChR的干擾RNA轉(zhuǎn)染人表皮微血管內(nèi)皮細胞72 h,饑餓過夜后用煙堿(10-10mol/L)處理，在煙堿處理后的不同時間點收集細胞上清液，將細胞上清用RPPM進行分析，結果顯示：與增殖相關的蛋白中，Raf-1, MEK, MAPK,ERK有明顯磷酸化。

與存活相關的蛋白中，Akt及BAD有磷酸化，課題組對這兩種蛋白的磷酸化動力學研究結果顯示：Akt在1 min內(nèi)就可被明顯激活，在30 min達到最大；BAD的磷酸化在60 min時達到最大，BAD是Bcl2超家族中的一員，它的磷酸化可以減低其抗凋亡的活性。因此，BAD的磷酸化是在Akt之后，這些結果顯示煙堿導致的BAD的活化是通過Akt進行調(diào)節(jié)，具體如圖2所示[14]。

圖2 煙堿介導的信號通路示意圖[14]

煙堿導致的信號通路中蛋白的活化可以被α7nAChR的干擾RNA所抑制，然而，α9nAChR的干擾RNA可以增加這些基本蛋白的磷酸化。這些蛋白的磷酸化都應用Western印跡進行了驗證。Wu等也進一步研究了煙堿導致NO產(chǎn)生的機制：內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO在血管新生中有重要的作用[14]，并有文獻報道Akt的磷酸化可以調(diào)節(jié)NO合成酶的活性，研究顯示煙堿能增加eNOS的磷酸化，應用PI3K抑制劑LY294002 (50 mmol/L)可以顯著降低NO的產(chǎn)生。

總之，煙堿導致內(nèi)皮細胞遷移和增殖的作用主要是激活α7nAChR介導的激酶及轉(zhuǎn)錄因子，這些機制對吸煙導致的動脈粥樣硬化中病理性的血管新生提供了潛在的治療靶點。

煙堿通過激活α7nAChR，開放離子通道調(diào)節(jié)Ca2+的流動。從而激活兩條主要的信號通路(PI3/Akt 及MAPK 通路)，導致內(nèi)皮細胞的增殖遷移，MAPK及Akt 的激活能能增加NO的合成，NO具有促進內(nèi)皮細胞遷移增殖的作用。煙堿可以引起VE-cadherin/β-catenin(VE-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白)復合物的解離及β-catenin的核轉(zhuǎn)位。與之相反，煙堿與α9nAChR結合后可以抑制這些信號通路。

5 nAChR作為治療動脈粥樣硬化的潛在靶點

許多研究顯示，nAChR在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，包括血管平滑肌細胞的增殖、遷移、斑塊中血管新生、單核細胞的黏附、巨噬細胞對LDL的攝取。因此，可以推測干擾nAChR的功能可以降低斑塊的生長以及新生血管的形成。Kanda等[15]研究表明nAChR拮抗劑-六烴季銨能在細胞水平抑制煙堿引起的大鼠血管平滑肌細胞的遷移，以及血管內(nèi)皮生長因子的分泌。最近研究顯示，nAChR類似物作為主動脈疾病診斷標志物的可能性。Bucerius 等[16]已經(jīng)闡明了用放射性同位素標記nAChR配體，然后用PET成像來觀察主動脈、主動脈弓和降支動脈成像的可能性[17]。這使基于影像學觀察動脈粥樣硬化患者中斑塊的面積成為可能。N受體在腦和肌肉的調(diào)節(jié)中具有重要作用，因此，需要考慮nAChR配體對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的副作用。然而，目前為止，尚未見到文獻報道在動物模型中nAChR類似物的毒副作用。

最近的研究表明，α1-nAChR可能會成為防治動脈粥樣硬化的一個有價值的分子靶點[18]。對高脂飲食處理后的ApoE-/-小鼠注射含α1-nAChR 干擾RNA的質(zhì)粒，可以降低α1-nAChR的表達水平，從而顯著降低動脈粥樣硬化斑塊的面積，影響斑塊中巨噬細胞的數(shù)量以及斑塊中的新生血管形成。這些發(fā)現(xiàn)論證了對α1-nAChR進行處理可能會成為動脈粥樣硬化的一種潛在治療策略。

Li等[19]證明α7-nAChR拮抗劑MLA能抑制大鼠血管平滑肌細胞的趨向性和遷移性。煙堿有促進大鼠血管平滑肌細胞的促進有絲分裂和抗凋亡作用，α7-nAChR拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-BT)可以抑制這種作用。斑塊新生血管的形成對斑塊的增長和穩(wěn)定具有重要的作用。用受體拮抗劑(α-BT，MLA)、小干擾RNA等生物方法干擾α7-nAChR的功能可以減弱缺血損傷模型中血管新生[20]。因此，α7-nAChR抑制劑可能對減輕動脈粥樣硬化斑塊血管新生起作用。然而，也有與此相爭議的報道，如激活α7-nAChR可以抑制炎癥以及降低巨噬細胞對LDL和膽固醇的吞噬。

6 結語

煙堿是香煙的一種主要成分，流行病學顯示其可促進AS的發(fā)生。研究表明煙堿可以與細胞表面的nAChR高度結合并發(fā)揮作用。nAChR是一種配體門控離子通道型受體，在炎癥、促進血管平滑肌細胞的遷移和新生血管形成等方面具有作用。因此，nAChR可成為動脈粥樣硬化新的干預靶點，為動脈粥樣硬化的治療帶來新的前景。

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