彭詞艷，胡 焰,2，王 霞,2，易利丹，彭六保，李健和*

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410011；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410013)

冠脈寧片由丹參等14味中藥材組成，具有活血化瘀、行氣止痛之功效，主要用于胸部刺痛、固定不移、入夜更甚、心悸不寧、舌質(zhì)紫暗、脈沉弦為主癥的冠心病、心絞痛、冠狀動脈供血不足等，臨床應(yīng)用多年安全有效[1,2]。該品種原載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑[3]，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有藥物性狀，以及丹參、葛根、血竭和冰片等藥材的薄層色譜鑒別和檢查項，不能全面地控制藥品的質(zhì)量。為保證本品臨床應(yīng)用效果及產(chǎn)品質(zhì)量，作者根據(jù)該方中藥物的理化性質(zhì)及中醫(yī)藥傳統(tǒng)制劑的特點，在原部頒標(biāo)準(zhǔn)的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[4-6]，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加雞血藤的薄層鑒別和丹參素的含量測定，制備工藝的優(yōu)化另文報道。

1 儀器和試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外檢測器(日本島津公司)；AE200電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。冠脈寧片(規(guī)格：0.31 g/片，批號 20120508、20120524、20120526、20120923、20120925、20120927、20120929、20121020、20121022、20121024、20130201、20130203、20130205，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部研制)；丹參素鈉對照品(批號 0855-201102，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸乙酯(天津市博迪化工有限公司)；乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；三氯甲烷(深圳市華昌化工有限公司)；甲酸(湖南省衡陽市有機化學(xué)試劑廠)；硬脂酸鎂(湖南華日制藥有限公司)；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。硅膠G板(青島海洋硅膠干燥劑有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 冠脈寧片的制備 按如下處方和制備工藝制備冠脈寧片。

2.1.1 處方 丹參112.5 g，沒藥(炒)25.5 g，雞血藤112.5 g，血竭25.5 g，延胡索(醋制)45 g，當(dāng)歸45 g，郁金45 g，制何首烏75 g，桃仁(炒)30 g，黃精(蒸) 75 g，紅花30 g，葛根112.5 g，乳香(炒)25.5 g，冰片4.5 g。上述藥材均購自湖南三湘中藥飲片有限公司，經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部中藥房王玉花副主任藥師鑒定。

2.1.2 制備工藝 取上述處方量的冰片研細(xì)；葛根、乳香、沒藥、血竭、郁金、延胡索粉碎成細(xì)粉，過80目篩備用；丹參、雞血藤、當(dāng)歸、制何首烏、桃仁、黃精、紅花加水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮3 h，第2次加8倍量水煎煮2 h，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮(75 ℃，-0.06 mPa)至相對密度為1.25(60 ℃測)的稠膏，與上述葛根等細(xì)粉混合，真空干燥(70 ℃，-0.06 mPa)。將干燥的提取物粉碎成細(xì)粉，過80目篩，混勻，加80%乙醇適量制成軟材，使用20目篩網(wǎng)制成顆粒，60 ℃干燥，加入冰片4.5 g及硬脂酸鎂1.5 g，混勻，壓片，包薄膜衣，制成1000片，即得。本品系將原糖衣片改為薄膜衣片，在沿用原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，將性狀修訂為：本品為薄膜衣片，除去包衣后顯紅棕色，味微苦、辛。

圖1 雞血藤的TLC圖

2.2 雞血藤的薄層鑒別 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇50 ml，加熱回流提取1 h。放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加重蒸餾水30 ml使溶解，用乙酸乙酯提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干。殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材1 g，加水煎煮30 min。放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯提取2次，其余操作同供試品溶液，得雞血藤對照藥材溶液。再取除雞血藤外的其余處方量藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B薄層色譜法實驗，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶0.3)為展開劑，展開。取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下觀察。結(jié)果顯示，供試品溶液和雞血藤對照藥材溶液的薄層板上相同位置處顯示有淡藍(lán)色的熒光斑點，而缺雞血藤的陰性樣品則不含此斑點，如圖1所示。說明冠脈寧片中的陰性樣品對雞血藤的薄層鑒別不產(chǎn)生干擾，故可在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加雞血藤的薄層鑒別。

2.3 丹參素的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-1%冰乙酸(10∶90)，流速：1.0 ml/min，檢測波長：280 nm。理論塔板數(shù)按丹參素峰計算應(yīng)不<2500。

2.3.2 溶液制備 (1) 供試品溶液：取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理(200 W，40 kHz)30 min。放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。(2) 對照品溶液：精密稱取丹參素鈉對照品5.95 mg，置50 ml容量瓶中，加50%甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻；然后再從中精密量取5 ml，置10 ml容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為53.55 μg/ml的丹參素鈉對照品溶液。(3) 陰性溶液：取除丹參外的其余處方量藥材，按制備工藝制成缺丹參的陰性樣品，同法制成缺丹參的陰性樣品溶液。

分別精密量取上述供試品、對照品、陰性樣品溶液各5 μl，注入HPLC儀，按2.3.1項進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。在該色譜條件下，丹素素的保留時間為15.5 min，陰性樣品溶液在該保留時間處不出峰，表明冠脈寧片中的其他成分對丹參素的測定無干擾。

圖2 冠脈寧片的HPLC譜圖

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.107 1 mg/ml的丹參素鈉對照品溶液1、3、5、7、9 ml，分別置10 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5 μl進(jìn)樣，測定其峰面積(A)，以濃度(c)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丹參素回歸方程為：A=510 502.4c-696.3(r=0.999 9)。結(jié)果表明，在10.71～96.39 μg/ml 范圍內(nèi)，丹參素濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度和穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液(批號 20120524)5 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，結(jié)果其平均峰面積為149 265.406，RSD為0.53%(n=5)，表明本法精密度良好。分別精密吸取供試品溶液(批號 20120524)5 μl，于0、2、4、8、10 h進(jìn)樣，測定其峰面積，結(jié)果其平均峰面積為149 383.512，RSD為0.62%(n=5)。表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性實驗 取同一批樣品(批號 20120524)5份，按上述條件平行處理并測定，結(jié)果其平均含量為0.539 1 mg/片，RSD為0.94%(n=5)，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率實驗 精密稱取已知丹參素含量為1.793 5 mg/g的供試品(批號 20120524)約0.4 g，精密加入丹參素鈉對照品溶液(0.086 8 mg/ml)10 ml，即0.868 mg，再精密加入甲醇15 ml，按上述含量測定項下的方法測定含量，測得其平均回收率為98.72%，RSD為0.82%(n=3)，表明本方法加樣回收率良好。

2.3.7 樣品含量測定 按擬定的含量測定方法，測定10批樣品中的丹參素的含量，結(jié)果見表1。10批樣品中丹參素含量的平均值為0.545 mg/片，RSD為2.05%。按平均含量的75%折算，暫定本品的含量限度為每片中丹參素含量不得<0.40 mg。

表1 10批樣品丹參素含量測定結(jié)果

3 討 論

本研究的薄層色譜實驗結(jié)果表明，供試品色譜中含有與雞血藤對照藥材相同的斑點，且其他成分不干擾，故將雞血藤的薄層鑒別收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中。供試品薄層色譜中未出現(xiàn)與延胡索、郁金、制何首烏、桃仁等對照藥材或?qū)φ掌飞V相同的斑點，故這些藥材的薄層鑒別不能作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而被收入。采用HPLC法對冠脈寧片中的丹參素含量進(jìn)行測定，其他成分對測定結(jié)果無干擾，方法學(xué)考察結(jié)果表明線性關(guān)系良好，精密度、回收率及重復(fù)性均較好，可用于本品的質(zhì)量控制，規(guī)定其限度為每片中丹參素含量不<0.40 mg。

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