方旅平，周 宸，黃瑞芳，林 琪，何麗斌，葛 輝，李少菁*

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

仿刺參[Apostichopusjaponicus(Selenka,1867)]隸屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirotida)仿刺參科(Stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus)，是我國(guó)重要的海洋養(yǎng)殖對(duì)象．仿刺參為溫帶種，因此仿刺參度夏是南移養(yǎng)殖的關(guān)鍵問題，當(dāng)進(jìn)入夏季后南方海域的水溫高于20 ℃時(shí)，仿刺參易于被海洋環(huán)境微生物所感染而患病，其中最常見的疾病是腐皮綜合征，如2008—2011年福建省養(yǎng)殖仿刺參發(fā)生腐皮綜合征，雖然未出現(xiàn)大規(guī)模死亡，但是這種疾病嚴(yán)重威脅著南方仿刺參養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展．

弧菌(Vibrio)在海洋環(huán)境中是普遍存在的，會(huì)以相當(dāng)高的密度出現(xiàn)在海洋生物的體內(nèi)或體表，包括珊瑚、魚類、貝類、頭足類、海綿、蝦類和浮游動(dòng)物等[1-2]．目前，包括燦爛弧菌(V.splendidus)、塔斯瑪尼弧菌(V.tasmaniensis)、伯麥羅氏弧菌(V.pomeroyi)等8個(gè)在系統(tǒng)發(fā)生上與燦爛弧菌相近的種類被合稱為燦爛弧菌復(fù)合群(V.splendidus-like complex)[2]，此復(fù)合群中已有種類被報(bào)道會(huì)引起海洋生物發(fā)病甚至死亡[3-5]．這一復(fù)合群中的弧菌其系統(tǒng)發(fā)育特征較為接近，而傳統(tǒng)的生化實(shí)驗(yàn)又耗時(shí)費(fèi)力，因而如果能利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)，將為海洋水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的鑒定提供更為便捷、準(zhǔn)確的鑒定方法．MALDI-TOF MS技術(shù)已在我國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)用于快速鑒定病原菌，得到了很好的結(jié)果[6]，但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病原微生物檢測(cè)上還很少被使用，僅有零星報(bào)道[7]．本研究將運(yùn)用該技術(shù)對(duì)分離自仿刺參的病原菌進(jìn)行鑒定，使該技術(shù)能在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌的鑒定領(lǐng)域內(nèi)得到更好的推廣．

本文圍繞南移仿刺參度夏期間腐皮綜合征的病原菌的致病性、生理生化特征、16S rRNA基因序列和蛋白質(zhì)譜分析等方面進(jìn)行了研究，為南移養(yǎng)殖仿刺參的病原檢測(cè)提供了新方法，并為仿刺參南移養(yǎng)殖地區(qū)的病害防治奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2008和2009年的夏季福建省養(yǎng)殖仿刺參均發(fā)生了腐皮綜合征.2009年8月，自福建莆田的養(yǎng)殖池中采集患病仿刺參，同時(shí)用于人工感染的健康仿刺參也同樣采購(gòu)于莆田.采集的樣品體質(zhì)量為5～10 g．患病仿刺參每個(gè)個(gè)體均進(jìn)行觀察并拍照．

1.2 細(xì)菌的分離與純化

選取具有典型癥狀的仿刺參，用滅菌海水清洗其體表，采用無菌操作，從患病部位(體壁)取樣約5 mm的組織塊，用無菌純水清洗數(shù)次，再用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和生理鹽水依次清洗．在清洗后，將組織塊分別轉(zhuǎn)接在2216E與硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)制成的瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h．觀察菌落形態(tài)，挑選優(yōu)勢(shì)菌落，劃線分離、多次純化后，直至獲得純培養(yǎng)物后再轉(zhuǎn)接到2216E、TCBS液體培養(yǎng)試管內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)18～24 h，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫摫４婢陿?biāo)記為SUS 1．

1.3 細(xì)菌回接感染實(shí)驗(yàn)

將-80 ℃低溫保存的菌株進(jìn)行活化，用于細(xì)菌回接感染實(shí)驗(yàn)．菌株SUS 1接種于TCBS瓊脂斜面，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng) 12 h后，用無菌生理鹽水洗脫，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整細(xì)菌濃度為1.0×108CFU/mL備用．

在回接感染實(shí)驗(yàn)前，將健康仿刺參暫養(yǎng)于過濾海水中，隨機(jī)分成2組，即對(duì)照組和感染組．在感染組中，隨機(jī)選取15只健康仿刺參分為3組，每組5只，分別注射制備好的菌懸液0.2 mL．而在對(duì)照組中，則是注射0.2 mL的無菌生理鹽水．所有的仿刺參均飼養(yǎng)在水溫25 ℃、鹽度27,50%換水量的環(huán)境下，觀察仿刺參的發(fā)病狀況．待感染仿刺參出現(xiàn)腐皮病癥狀后，同上述方法挑選優(yōu)勢(shì)菌落，再重復(fù)感染．將每一次回接感染后分離培養(yǎng)所得到的菌株分別標(biāo)記為SUS 2、SUS 3，并分別對(duì)其進(jìn)行鑒定．

1.4 注射感染和浸浴感染致病效果實(shí)驗(yàn)

在對(duì)仿刺參進(jìn)行上述回接感染的實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其體壁組織較為特殊，注射的體積相應(yīng)要降低，否則注射的菌液將有部分溢出損失．因而在注射感染實(shí)驗(yàn)中，將菌株SUS 1、SUS 2與SUS 3用無菌生理鹽水制備成3.0×108CFU/mL菌懸液，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至 3.0×107,3.0×106CFU/mL．將135只健康仿刺參隨機(jī)分成9組，每組15只，其中每3組仿刺參作為一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行菌株SUS 1、SUS 2與SUS 3的人工注射實(shí)驗(yàn)．以菌株SUS 1為例，有2組分別注射0.1 mL的2個(gè)濃度梯度的SUS 1菌懸液，其余1組注射0.1 mL的無菌生理鹽水作為對(duì)照．觀察記錄仿刺參發(fā)病癥狀及死亡情況．

在浸浴實(shí)驗(yàn)中，水體中的菌落終濃度分別為3.0×108和3.0×107CFU/mL．實(shí)驗(yàn)仿刺參的數(shù)量和分組情況同上，并觀察記錄仿刺參發(fā)病癥狀和死亡情況．

將記錄的每日死亡仿刺參數(shù)量用Graphpad prism 軟件進(jìn)行分析每日仿刺參死亡率．

1.5 細(xì)菌的生理生化指標(biāo)測(cè)定

細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)按《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]方法進(jìn)行．本研究中主要采用了API 20E和API 半自動(dòng)化鑒定方法．

1.6 細(xì)菌的質(zhì)譜分析方法

首次分離得到的菌株SUS 1以及人工回接感染后分離培養(yǎng)的SUS 2、SUS 3，分別用MALDI-TOF MS方法進(jìn)行鑒定．具體操作方法如下：挑取菌落，純化培養(yǎng)后，接種肉湯，37 ℃培養(yǎng)18～24 h．取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管中，10 000 r/min離心1 min，棄上清，生理鹽水洗滌2遍，棄上清．加入300 μL超純水，混勻，再加入900 μL無水乙醇，混勻．高速離心2 min，棄去上清(必要時(shí)，再離心一次，盡量去除乙醇)．加入50 μL 70%(體積分?jǐn)?shù))甲酸和50 μL乙腈，混勻，高速離心2 min，吸取上清液點(diǎn)樣．

將樣品板置于板孔中，加有樣品一面朝上，蓋上蓋子，抽真空．打開儀器控制軟件FlexControl調(diào)好儀器參數(shù)，校準(zhǔn)儀器．手動(dòng)采集標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的質(zhì)譜圖，以線性正性模式用最大頻率采集．每個(gè)樣品重復(fù)4次以上．譜圖也可以自動(dòng)獲取，用autoExecute軟件使用激光強(qiáng)度的模糊控制來進(jìn)行．

采集細(xì)菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)后利用分析軟件Biotyper，選擇細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，調(diào)入并選中樣品數(shù)據(jù)．選擇菜單命令I(lǐng)dentification/start identification進(jìn)行鑒定；選擇菜單命令Report/show report顯示鑒定報(bào)告；選擇菜單命令File/save as把報(bào)告存到文件目錄．

1.7 細(xì)菌16S rRNA基因片段序列分析

取10 μL過夜培養(yǎng)的菌液，置于PCR反應(yīng)管中，離心，去除培養(yǎng)基，加10 μL 滅菌超純水于99 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，上清即為細(xì)菌DNA，可作為PCR模板．

本研究中細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，是采用該基因的一對(duì)通用性引物，具體引物序列如下：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)．PCR擴(kuò)增體系：5 μL 10×PCR緩沖液，200 mmol/L dNTPs,0.4 mmol/L引物，1.25 U ExTaq polymerase聚合酶 (TaKaRa Biotechnology Co.，大連)，1 μL細(xì)菌DNA．PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃變性 5 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min)，72 ℃延伸10 min．PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至南京金斯瑞生物公司測(cè)序．

測(cè)序獲得的核酸序列利用BLAST在GenBank中比對(duì)相近序列，用MEGA 4.0軟件Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap=1 000)．

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的回接感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離菌人工感染后，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)表皮潰爛癥狀，而對(duì)照組無任何癥狀．在感染早期階段，被感染的個(gè)體表現(xiàn)出虛弱、進(jìn)食減少、回轉(zhuǎn)擺動(dòng)等癥狀．之后其體壁顏色變得灰暗，逐漸褪色，并分泌大量的黏液．表皮開始出現(xiàn)白色小點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大，深入內(nèi)層并相互合并．人工回接感染實(shí)驗(yàn)后，仿刺參均出現(xiàn)與自然發(fā)病相同的癥狀(圖1)．因而，該結(jié)果可以確定本次實(shí)驗(yàn)分離出的細(xì)菌是導(dǎo)致度夏刺參腐皮綜合征的病原菌．

2.2 仿刺參注射感染和浸浴感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

進(jìn)行注射感染和浸浴感染實(shí)驗(yàn)后，仿刺參每日死亡率如圖2和3所示．仿刺參在人工注射感染和浸浴感染實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)了腐皮綜合征癥狀，并隨著時(shí)間推移出現(xiàn)死亡．其中，人工注射感染組均在第2天就出現(xiàn)死亡個(gè)體，有4組仿刺參在第7天死亡率就達(dá)到了100%．在浸浴感染組中，仿刺參直至第4天才出現(xiàn)死亡個(gè)體，僅有1組仿刺參在第7天死亡率達(dá)到100%．

2.3 菌株生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

病原菌在TCBS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，形成黃色、半透明、凸起的具有光滑邊緣的直徑4 mm的圓形單菌落．菌落能在35 ℃生長(zhǎng)，4 ℃和40 ℃不生長(zhǎng)．生化特征為革蘭氏陰性；β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase)陽(yáng)性；尿素酶(urease)、精氨酸雙水解酶(arginine dihydrolase)、賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase)和鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase)等陰性．該菌株發(fā)酵蔗糖(sucrose)和甘露醇(mannitol)，但不發(fā)酵阿拉伯糖(arabinose)、肌醇(inositol)、鼠李糖(rhamnose)或山梨糖(sorbitol)．下列化合物能被其利用：纖維二糖(cellobiose)、N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)、麥芽糖(maltose)、乳酸(lactic acid)、L-天冬氨酸(L-aspartic acid)．沒有一個(gè)菌株能利用：丙酸(propionic acid)，枸櫞酸鹽(citrate)，側(cè)金盞花醇(adonitol)，M-肌醇(m-inositol)，檸檬酸(citric acid)或癸二酸(sebacic acid)．其他指標(biāo)見表1．

(a)、(b)：度夏過程中自然發(fā)病的仿刺參；(c):1.對(duì)照組(健康)仿刺參個(gè)體,2.人工回接感染組仿刺參個(gè)體，感染白點(diǎn)已經(jīng)擴(kuò)大(A部位), 3.人工回接感染組仿刺參個(gè)體，體表出現(xiàn)小白點(diǎn)(B部位),4.人工回接感染組仿刺參個(gè)體，潰爛部位互相融合(C部位).圖1 仿刺參人工回接感染后的觀察Fig.1 Observation of sea cucumber A. japonicus after recursive infection

圖2 仿刺參人工注射V. pomeroyi SUS感染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of artificial injection test with strain V. pomeroyi SUS to A. japonicus

圖3 仿刺參V. pomeroyi SUS浸浴感染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The results of immersiontest with strain V. pomeroyi SUS to A. japonicus

2.4 菌株的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2010年進(jìn)行人工回接感染實(shí)驗(yàn)中，菌株SUS 1、SUS 2和SUS 3的飛行質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果見圖4的(b)、(c)、(d)，其MPS值(MALDI Spectrum Match Scores)均為2.034(見表2)，MPS值均大于2.000．在該鑒定系統(tǒng)中，當(dāng)MPS值處于范圍2.000～3.000時(shí)，該系統(tǒng)鑒定結(jié)果能確認(rèn)到種(species identification)，使用綠色標(biāo)記；當(dāng)值處于1.700～1.999時(shí)，該系統(tǒng)能確認(rèn)到屬(genus identification)，使用黃色標(biāo)記；當(dāng)值處于0.000～1.699 時(shí)，則系統(tǒng)無可靠的鑒定結(jié)果(not reliable identification)，使用紅色標(biāo)記．本次實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果匹配的菌株是V.pomeroyiDSM 17180 HAM，因此，本次實(shí)驗(yàn)分離純化的病原菌鑒定為伯麥羅氏弧菌，本課題組將菌株命名為V.pomeroyiSUS．

其中，值得一提的是菌株SUS 1在2009年12月被分離純化培養(yǎng)后第一次被測(cè)定，其質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果見圖4(a),之后保存于-80 ℃直至2010年9月被再次測(cè)定．質(zhì)譜的測(cè)定分析的MPS值分別為2.086和2.034，雖然數(shù)值不同，但鑒定結(jié)果均為伯麥羅氏弧菌．

2.5 病原菌基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

本研究測(cè)定了病原菌菌株SUS 1～SUS 3的16S rRNA基因片段序列，序列長(zhǎng)度分別為1 425，1 357，1 357 bp，已經(jīng)提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：KF743852、KF743853、KF743854)．綜合生理生化特征研究結(jié)果和質(zhì)譜鑒定結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取以下序列以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T和非典型菌株V.pomeroyiDHQ2，典型菌株V.gigantisLGP 13，典型菌株V.chagasiiLMG 21353，典型菌株V.splendidusATCC 33125T和非典型菌株V.splendidusLMG 10952．使用DNAMAN軟件5.0編輯序列，將序列長(zhǎng)度統(tǒng)一截取為1 204 bp，利用軟件MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，其中霍亂弧菌(V.choleraestain ATCC 14035T)作為外群(outgroup)．同時(shí)，DNAMAN 5.0也計(jì)算得出SUS 1～SUS 3的16S rRNA基因片段序列與典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T的序列相似度分別為98.9%、98.9%和98.8%．

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，3株菌株(SUS 1～3)是同一種，屬于燦爛弧菌復(fù)合群．該病原菌與V.pomeroyiDHQ2的關(guān)系最近，而與典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T在系統(tǒng)發(fā)生樹中并沒有最先歸為一支．

綜合3種研究方法的鑒定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)分離獲得的度夏仿刺參腐皮綜合征的病原菌為V.pomeroyiSUS．

3 討 論

3.1 細(xì)菌鑒定方法的比較

海洋細(xì)菌鑒定曾長(zhǎng)期困擾著研究人員．然而，隨著新技術(shù)的發(fā)展，鑒定物種已變得更為迅速及準(zhǔn)確，例如目前分子生物學(xué)技術(shù)被日益廣泛地應(yīng)用于鑒別細(xì)菌種類的熒光素標(biāo)記選擇性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(FAFLP)、DNA-DNA雜交、基因測(cè)序等．在細(xì)菌和古細(xì)菌的線粒體和葉綠體中，核糖體小亞基包含16S rRNA基因．隨著時(shí)間的推移，其功能沒有改變，并且攜帶足夠多的生物信息，因此，16S rRNA基因可用于物種分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究[10]．當(dāng)細(xì)菌或古細(xì)菌的不同物種間具有相當(dāng)高的保守性時(shí)，還可以通過該基因評(píng)估物種分化的速率[11]．

表1 伯麥羅氏弧菌各菌株間的表型特征變化比較Tab.1 Variable phenotypic features among strains of V. pomeroyi

注：1～4分別為伯麥羅氏弧菌的不同菌株，具體為:1.V.pomeroyiSUS 1 (菌落1)；2.V.pomeroyiSUS 2 (菌落2)； 3.V.pomeroyi(n=6)(含V.pomeroyiLMG 20537T)(Thompson等,2003)；4.V.pomeroyi929(Beleneva等,2010).

+.陽(yáng)性；—.陰性；ND.無數(shù)據(jù)；v.變化；type strain.典型菌株.

但是，我們認(rèn)為16S rRNA基因序列用于鑒定物種，雖是一種可行的方法，卻受限于其有限的數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息．例如基因數(shù)據(jù)庫(kù)提交的序列大多是非完整的基因序列，序列片段的信息量較少；在提交序列時(shí)，并無相關(guān)物種符合性的審核，僅是一個(gè)共享數(shù)據(jù)庫(kù)．所以在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)往往可能出現(xiàn)結(jié)果偏差．此外，16S rRNA基因序列在弧菌屬內(nèi)保守性很高，特別是被鑒定的菌種屬于一個(gè)復(fù)合群時(shí)，其序列更為相似，在鑒定這些種類時(shí)僅利用16S rRNA的部分基因序列其準(zhǔn)確度往往受到質(zhì)疑，更難以準(zhǔn)確地甄別．本文中的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖5)可以看出，由于燦爛弧菌復(fù)合群中的種類在系統(tǒng)發(fā)生上具有很高的相似性，作為燦爛弧菌復(fù)合群中的同一種細(xì)菌的不同菌株，例如：燦爛弧菌、伯麥羅氏弧菌，若僅利用16S rRNA的部分基因序列與該復(fù)合群的其他種類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析時(shí)，2個(gè)同種的菌株并非在最接近的位置．因此，測(cè)序結(jié)果分析僅能表明本研究分離獲得的病原菌與V.pomeroyiDHQ2的親緣關(guān)系最為接近．

(a)菌株SUS 1分離純化后的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果;(b)菌株SUS 1冷凍保存活化后的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果; (c)菌株SUS 2的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果;(d)菌株SUS 3的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果.圖4 伯麥羅氏弧菌質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果Fig.4 Mass spectrometric profiles of V. pomeroyi

菌株預(yù)備程序測(cè)試時(shí)間鑒定種類MPS值SUS 1LBglc2009-12-18V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.086SUS 1LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034SUS 2LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034SUS 3LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034

圖5 基于16S rRNA基因序列的菌株SUS 1～3的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of strains SUS 1-3 based on partial 16S rRNA sequences

為了能快捷準(zhǔn)確地鑒定病原菌，除了運(yùn)用16S rRNA基因序列測(cè)序分析以外，引入MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行鑒定，同時(shí)在進(jìn)行鑒定分析時(shí)結(jié)合了微生物數(shù)據(jù)庫(kù)MALDI Biotyper系統(tǒng)．以往利用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定微生物，大部分都集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域或食品檢測(cè)領(lǐng)域，Cherkaou等[12]與曾白華等[13]正是在對(duì)臨床微生物的MALDI-TOF MS技術(shù)運(yùn)用的研究中指出傳統(tǒng)的鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，而MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)將比傳統(tǒng)的表型特征鑒定方法更為經(jīng)濟(jì)和快捷，在準(zhǔn)確度上與傳統(tǒng)方法等同甚至更為準(zhǔn)確．該技術(shù)的另一重要優(yōu)勢(shì)是，其對(duì)細(xì)菌鑒定的高度可重復(fù)性是基于某些高豐度蛋白的測(cè)定，其中包括許多核糖體蛋白，因?yàn)楹颂求w蛋白是細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制的一部分，它們存在于所有的活細(xì)胞中，因而質(zhì)譜蛋白指紋技術(shù)幾乎不受生長(zhǎng)和環(huán)境條件變化的影響[14]．在本研究中，菌株SUS 1前后測(cè)定了2次，第1次為2009年通過分離純化獲得的菌落，第2次是經(jīng)過-80 ℃保存約9個(gè)月后重新活化后的菌落．2次測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果通過軟件BioTyper 2.0分析其值分別為2.086和2.034，雖然數(shù)值略有差異，但軟件給出的鑒定結(jié)果均為V.pomeroyiDSM 17180，該菌株為伯麥羅氏弧菌的典型菌株．此外，菌株SUS 1冷凍保存活化后用于人工回接感染，每次感染后重新分離培養(yǎng)獲得的SUS 2、SUS 3菌株在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，其測(cè)定值均為2.034．可見，該技術(shù)在鑒定細(xì)菌時(shí)具有很好的重復(fù)性，這與其他研究人員[15-17]得出結(jié)論相同，針對(duì)非發(fā)酵型細(xì)菌，以MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的鑒定方法為細(xì)菌鑒定提供了準(zhǔn)確、重復(fù)性良好的結(jié)果．

總之，MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合Biotyper微生物數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的鑒定方法是一種鑒定海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性高的方法．

3.2 伯麥羅氏弧菌的致病性

仿刺參誘導(dǎo)腐皮病發(fā)病的相關(guān)微生物已有研究，例如，已有報(bào)告指出多種屬于γ-變形菌亞門(γ-protebacteria，theAlteromonadalesandVibrionalesgroups)的菌株，是引起仿刺參腐皮病發(fā)病的主要細(xì)菌類群[18]．此外，從仿刺參潰爛皮膚和腫大口緣組織處分離的菌株已被確定為一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)和河豚毒素假交替單胞菌(P.tetraodonis)[19]．但國(guó)內(nèi)大部分仿刺參疾病的研究對(duì)象是北方養(yǎng)殖仿刺參群體，本文著重研究仿刺參在南方度夏期間發(fā)生腐皮綜合征的病原菌．實(shí)驗(yàn)中，從患病仿刺參上分離的伯麥羅氏弧菌感染健康仿刺參后，觀察到了與自然發(fā)生的疾病中同樣的癥狀．從人工感染發(fā)病的仿刺參上再次分離到該菌株，并再次驗(yàn)證，這符合了病原微生物確認(rèn)的科赫法則．同時(shí)，人工感染實(shí)驗(yàn)采用了注射和浸泡2種方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明機(jī)械性皮膚損傷并不是發(fā)病所必需的條件，浸泡感染實(shí)驗(yàn)中，仿刺參同樣也會(huì)發(fā)病．當(dāng)然，與浸泡感染相比，注射感染更容易發(fā)病．

該菌在以往的仿刺參腐皮病綜合癥病原菌的研究中未被報(bào)道，并且在以往國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)伯麥羅氏弧菌的研究中，伯麥羅氏弧菌未被發(fā)現(xiàn)是誘導(dǎo)水生生物發(fā)病的病原體，僅僅作為一種分布在海洋環(huán)境中或生存于海洋生物體內(nèi)的微生物被報(bào)道．2003年Thompson等[20]首次在巴西南部的一種扇貝Nodipectennodosus的健康幼蟲中分離獲得伯麥羅氏弧菌．此外，在日本沿海魚類腸道中也發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌[21]．來自于Hell Vent的一種蠕蟲伯麥?zhǔn)匣【?Paralvinellasulfincola)中分離的菌株與從Nodipectennodosus幼蟲分離獲得的伯麥?zhǔn)匣【南嗨菩愿哌_(dá)99.8%[22]．伯麥羅氏弧菌也曾被報(bào)道從光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)的腸道內(nèi)含物中被分離獲得[23]．國(guó)內(nèi)對(duì)伯麥羅氏弧菌的相關(guān)研究極少，陳君[24]在研究來自于半滑舌鰨的病原菌時(shí)，獲得一株優(yōu)勢(shì)菌未能確定菌種，在系統(tǒng)發(fā)育樹中疑似伯麥羅氏弧菌，并指出它的致病性仍然未知．黨法斌等[25]在利用幾種海藻多酚對(duì)魚類致病菌的抑菌性研究中，將海洋弧菌屬中的海神弧菌(V.brasiliensis)、巴西弧菌、徐氏弧菌(V.xuii)、查格斯氏弧菌(V.chagasii)、鰻弧菌(V.anguillarum)、伯麥羅氏弧菌及哈維氏弧菌(V.harveyi)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行了生長(zhǎng)的抑制性實(shí)驗(yàn)，這其中并未指明伯麥羅氏弧菌能導(dǎo)致的魚類疾?。?/p>

因此，本研究結(jié)果不僅確認(rèn)了伯麥羅氏弧菌對(duì)海洋生物的致病性，而且對(duì)南移仿刺參疾病的檢測(cè)和預(yù)防累積了相關(guān)的資料．

3.3 伯麥羅氏弧菌不同菌株的特征比較

V.pomeroyiLMG 20537T[20]來自巴西南部，V.pomeroyi929[23]采集自日本海，這2個(gè)菌株作為本研究獲得V.pomeroyiSUS菌株表型比較分析的對(duì)象．通過對(duì)比，V.pomeroyiSUS菌株的生理特性與V.pomeroyiLMG20537T及V.pomeroyi929基本一致．不同的是，本研究中的V.pomeroyiSUS可在35 ℃下生長(zhǎng)，但無法在4 ℃下生長(zhǎng)；此外與典型菌株不同的，V.pomeroyiSUS和V.pomeroyi929均無法在含8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)．而在已有的研究報(bào)道中，細(xì)菌的生態(tài)相關(guān)特征被認(rèn)為可能會(huì)反映出海洋環(huán)境對(duì)菌株的影響[23]．

本研究是在夏季分離純化獲得菌株V.pomeroyiSUS，采樣地點(diǎn)位于福建莆田平海．根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道莆田平海仿刺參南移養(yǎng)殖區(qū)域的海水水溫變化范圍為13.7～32.7 ℃[26]．可以看出，福建莆田的海水溫度在夏季達(dá)到30 ℃以上，有時(shí)高達(dá)32.7 ℃．而伯麥羅氏弧菌的典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T分離自來源于巴西南部的圣卡塔琳娜州(Santa Catarina)的首府弗洛里亞諾波利斯(Florianópolis)的Nodipectennodosus的健康幼體．該海域具有優(yōu)良的海水條件，建立了許多貝類養(yǎng)殖場(chǎng)，弧菌是該區(qū)域海水中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群．Rupp等[27]在研究圣卡塔琳娜州沿岸的Nodipectennodosus幼體深度和放養(yǎng)密度對(duì)其生長(zhǎng)的影響時(shí)提到該海域受到南大西洋中央水(south atlantic central water，SACW)的影響，該洋流水溫低，即使在夏季，由于溫暖的巴西流的緣故，該海域表層水溫較高，但最高為28 ℃[28]，而在受到SACW影響的水域溫度甚至能低于20 ℃[27]．另一菌株V.pomeroyi929采集自彼得大帝灣(Peter the Great Bay)，該海灣是日本海最大的海灣，處于西北太平洋邊緣[29]．在冬季，沿岸水溫下降至-1或-2 ℃，開放海區(qū)水溫會(huì)稍高一些；在夏季，海灣表層水溫較高，但在8月內(nèi)灣的表層水溫最高也僅能達(dá)24～26 ℃[29]．可以看出，莆田平海仿刺參南移養(yǎng)殖區(qū)域的水溫比后兩者表層水溫高得多，因而，本研究分離所得的菌株V.pomeroyiSUS對(duì)高溫的適應(yīng)性更好，能在35 ℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，而另兩地分離的菌株無法在此溫度條件下培養(yǎng)，卻能在較低的溫度，如4 ℃下生長(zhǎng)．

對(duì)鹽度這個(gè)生態(tài)因子來說，莆田平海仿刺參南移養(yǎng)殖區(qū)域的鹽度為30.40～31.65[26]，鹽度相對(duì)穩(wěn)定，鹽度最高也未超過32．彼得大帝灣分離的菌株V.pomeroyi929處所該海灣的開放區(qū)表層鹽度介于32至33，但是由于徑流的影響，在內(nèi)灣靠近河口的區(qū)域鹽度將會(huì)下降10%～20%或者降水量大時(shí)下降較多[21]，因而該菌株相比而言對(duì)低鹽度的耐受性較強(qiáng)．三地中，圣卡塔琳娜州扇貝養(yǎng)殖區(qū)所處海域受到南大西洋中央水(SACW)的影響，該洋流鹽度較高，約為35，并且即使在12 m深處，一年的大部分季節(jié)其鹽度仍然保持在將近33[27]．分析這3株菌株所處的海域環(huán)境的鹽度特征后發(fā)現(xiàn)，3株菌株的相關(guān)生態(tài)特性與海域鹽度因子間存在一定的聯(lián)系，來自于巴西圣卡塔琳娜州鹽度較高海域的的典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T能在含8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而2株采集自鹽度相對(duì)較低海域的菌株則無法在含8%NaCl培養(yǎng)基上存活．

分析本研究獲得的菌株V.pomeroyiSUS的生理生化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，表明該菌株具有適應(yīng)較高溫度和較低鹽度環(huán)境的特點(diǎn)．同樣，LMG 20537T和929菌株也分別表現(xiàn)出適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境的生態(tài)特征．此外，V.pomeroyiSUS和V.pomeroyiDSM 17180 HAM菌株通過MALDI Biotyper系統(tǒng)比較分析匹配值僅略大于2，這反映2個(gè)菌株之間存有一定差異．同樣地，16S rRNA基因測(cè)序分析的結(jié)果也反映了來自不同地區(qū)的菌株的多樣性．因此，本研究分離純化的V.pomeroyiSUS和其他菌株之間的確具有某些差異，不論是在生理生化特征上，還是在遺傳特征和蛋白指紋圖譜方面均有自己的特征．然而，這些差異目前是否已經(jīng)達(dá)到變異亞種水平，還需要進(jìn)一步研究．

[1] Adeleye A,Enyinnia V,Rita N,et al.Antimicrobial susceptibility of potentially pathogenic halophilicVibriospecies isolated from seafoods in Lagos,Nigeria[J].Afr J Biotechnol,2008,7(20):3791-3794.

[2] Beaz-Hidalgo R,Doce A,Pascual J,et al.Vibriogallaecicussp.nov.isolated from cultured clams in north-western Spain[J].Syst Appl Microbiol,2009,32:111-117.

[3] Castro D,Pujalte M J,Lopez-Cortes L,et al.Vibrios isolated from the cultured manila clam (Ruditapesphilippinarum):numerical taxonomy and antibacterial activities[J].J Appl Microbiol,2002,93:438-447.

[4] Gómez-León J,Villamil L,Lemos M L,et al.Isolation ofVibrioalginolyticusandVibriosplendidusfrom aquacultured carpet shell clam (Ruditapesdecussatus) larvae associated with mass mortalities[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(1):98-104.

[5] 馬愛敏，閆茂倉(cāng)，胡利華，等.患潰爛癥的眼斑擬石首魚分離的燦爛弧菌的鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2010，50(4)：542-547.

[6] 陳信忠，龔艷清，郭書林.MALDI-TOF-MS 在病原微生物鑒定中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012，6：43-48.

[7] 張飛，蘇永全，王軍，等.大黃魚(Pseudosciaenacrocea)源美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)的分離鑒定及致病性研究[J].海洋與湖沼，2012，43(6)：1202-1208.

[8] Holt J G.Bergey′s manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimore,USA:Lippincott Williams and Wilkins,1994.

[9] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[10] Weisburg W G，Barns S M,Pelletier D A,et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173(2):697-703.

[11] Coenye T,Vandamme P.Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes[J].FEMS Microbiol Lett,2003,228(1):45-49.

[12] Cherkaoui A,Hibbs J,Emonet S,et al.Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level[J].J Clin Microbiol,2010,48(4):1169-1175.

[13] 曾白華，呂連華，王開正，等.臨床細(xì)菌學(xué)鑒定方法進(jìn)展[J].西南軍醫(yī)，2012，14(3)：509-510.

[14] Jarman,K H,Daly D S,Petersen C E,et al.Extracting and visualizing matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectral fingerprints[J].Rapid Commun Mass Spectrom,1999,13(15):1586-1594.

[15] Hinsea D,Vollmera T,Erhardb M,et al.Differentiation of species of the Streptococcus bovis/equinus-complex by MALDI-TOF mass spectrometry in comparison to sodA sequence analyses[J].Syst Appl Microbiol,2011,34(1):52-57.

[16] Mellmann A,Cloud J,Maier T,et al.Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria[J].J Clin Microbiol,2008,46(6):1946-1954.

[17] Gaiaa V,Casatia S,Tonolla M.Rapid identification ofLegionellaspp. by MALDI-TOF MS based protein mass fingerprinting[J].Syst Appl Microbiol,2011,34(1):40-44.

[18] Ma H Y,Jiang G L,Wu Z Q,et al.16S rRNA Gene Phylogenesis of culturable predominant bacteria from diseasedApostichopusjaponicus(Holothuroidea,Echinodermata)[J].J Ocean Univ China (Oceanic and Coastal Sea Research),2009,8(2):166-170.

[19] Liu H Z,Zheng F R,Sun X Q,et al.Identification of the pathogens associated with skin ulceration and peristome tumescence in cultured sea cucumbersApostichopusjaponicus(Selenka)[J].J Invertebr Pathol,2010,105(3):236-242.

[20] Thompson F L,Thompson C C,Li Y,et al.Vibriokanaloaesp.nov.,Vibriopomeroyisp.nov.andVibriochagasiisp.nov.,from sea water and marine animals[J].Int J Syst Evol Microbiol,2003,53:753-759.

[21] Schornikov E I.Checklist of the ostracod (Crustacea) fauna of Peter the Great Bay,Sea of Japan[J].Zootaxa,2006,1294:29-59.

[22] Csotonyi J T,Stackebrandt E,Yurkov V.Anaerobic respiration on tellurate and other metalloids in bacteria from hydrothermal vent fields in the eastern Pacific Ocean[J].Appl Environ Microbiol,2006:4950-4956.

[23] Beleneva I A,Kukhlevskii A D.Characterization ofVibriogigantisandVibriopomeroyiisolated from invertebrates of Peter the Great Bay,Sea of Japan[J].Microbiol,2010,79(3):402-407.

[24] 陳君.工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖半滑舌鰨主要細(xì)菌性疾病及其控制[D].上海：上海海洋大學(xué),2012.

[25] 黨法斌，王偉，陳賡超，等.幾種海藻多酚對(duì)魚類致病菌的抑菌性研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(8)：499-501.

[26] 王春忠.仿刺參的池塘吊養(yǎng)試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2007，34(1)：13-15.

[27] Rupp G S,Parsons G J,Thompson R J,et al.Effect of depth and stocking density on growth and retrieval of the postlarval lion′s paw scallop,Nodipectennodosus(Linnaeus,1758)[J].J Shellfish Res,2004,23(2):473-482.

[28] Rupp G S,Parsons G J.Effects of salinity and temperature on the survival and byssal attachment of the lion′s paw scallopNodipectennodosusat its southern distribution limit[J].J Exp Mar Biol Ecol,2004,309:173-198.

[29] Vashchenko M A.Pollution in Peter the Great Bay,Sea of Japan,and its biological consequences[J].Russ J Mar Biol,2000,26(3):155-166.