張藍藍，王世珍，朱春杰，方柏山,3*

(1.廈門大學化學化工學院，2.廈門市合成生物技術(shù)重點實驗室(廈門大學)，3.醇醚酯化工清潔生產(chǎn)國家工程實驗室(廈門大學)，福建 廈門 361005)

1,3-丙二醇是一種廣泛用于制備聚酯、聚醚和聚氨酯的重要單體原料[1-4]，這類聚合物合成塑料具有生物可降解性等許多其他二元醇所不具有的優(yōu)良性質(zhì)，因而1,3-丙二醇在有機合成領(lǐng)域的應(yīng)用正日益增加．

填充床固定化細胞生物反應(yīng)器操作簡單、易于擴大生產(chǎn)規(guī)模，可實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，生產(chǎn)費用較低，但難以清除細胞，混合度較差[5]．膜式固定化細胞生物反應(yīng)器催化效率很高，易于放大及控制反應(yīng)過程，下游處理簡便，是目前連續(xù)化大生產(chǎn)中應(yīng)用最多的一種生物反應(yīng)器[6]．目前，利用生物法發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇主要有分批發(fā)酵、補料發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵3種方式，不同的發(fā)酵方式對最終產(chǎn)物的濃度及時空產(chǎn)率都有著較大的影響[3,5,7-9]．Pflügl等[10]利用Lactobacillusdiolivorans進行補料分批發(fā)酵，通過控制培養(yǎng)基中葡萄糖和甘油的摩爾比及添加維生素B12的方式，1,3-丙二醇最高質(zhì)量濃度可達84.5 g/L．Zhao等[11]利用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)進行連續(xù)發(fā)酵，1,3-丙二醇最高質(zhì)量濃度達到13.6 g/L，時空產(chǎn)率為4.49 g/(L·h)，摩爾得率為43%．而Casali等[12]利用填充床反應(yīng)器固定化成團泛生菌(Pantoeaagglomerans)菌體進行連續(xù)發(fā)酵，在水力停留時間為2 h時時空產(chǎn)率達到最高值3.6 g/(L·h)．而利用棉纖維織物、聚乙烯醇縮甲醛(PVF)柱體、活性炭顆粒固定化丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)進行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究尚未報道，故本文考慮采用不同的固定化載體及不同的連續(xù)發(fā)酵條件對其進行初步研究，旨在提高菌株的發(fā)酵生產(chǎn)能力，為今后大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵應(yīng)用打下基礎(chǔ)．

1 實驗材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

丁酸梭菌(ClostridiumbutyricumCGMCC 6317)．4 ℃保存于生長培養(yǎng)基．

1.1.2 培養(yǎng)基

1) 生長培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉3，葡萄糖5，NaCl 3，NaAc 3，可溶性淀粉1，半胱氨酸鹽酸鹽0.5；pH 7.5．

2) 種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油20，K2HPO4·3H2O 4.45，KH2PO41.3，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.02，酵母粉1；另加微量元素溶液1 mL，F(xiàn)e溶液1 mL．

3) 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油，視具體情況而定；K2HPO4·3H2O 1，KH2PO40.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.02，酵母粉1；另加微量元素溶液1 mL，F(xiàn)e溶液 1 mL；pH 7．

4) 補料培養(yǎng)基：甘油及酵母粉視具體情況而定，其余同種子培養(yǎng)基．

5) 微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl2·2H2O 0.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035；HCl(質(zhì)量分數(shù)37%，下同)0.9 mL．

6) Fe溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 5；HCl(37%)4 mL．

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

1) 培養(yǎng)基制備：將配制好的培養(yǎng)基分裝至血清瓶，通氮氣除氧30 min，使用膠塞和鋁蓋密封，高壓滅菌(121 ℃，20 min)；補料培養(yǎng)基滅菌后持續(xù)通入無菌氮氣，以保持厭氧環(huán)境．

2) 種子培養(yǎng)：用無菌注射器取2 mL菌液接種至內(nèi)含50 mL種子培養(yǎng)基的血清瓶，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)16 h；再以10%(體積分數(shù)，下同)的接種量轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)條件同前，4 h后接入發(fā)酵罐培養(yǎng)．

3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10%的接種量轉(zhuǎn)接入罐中發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min、35 ℃、pH 7.0條件下恒溫培養(yǎng)一定時間．

4) 連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)：將新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基用恒流泵以恒定流速(依具體實驗而定)輸入固定化反應(yīng)器，反應(yīng)器保持在35 ℃水浴恒溫條件下；流出液取樣點為反應(yīng)器出口處；反應(yīng)器與發(fā)酵罐連成回流系統(tǒng)，采用蠕動泵控制回流系統(tǒng)內(nèi)部循環(huán)流速為2 mL/min；發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1 L；采用發(fā)酵罐控制整個系統(tǒng)pH為 7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min．

5) pH調(diào)節(jié)：除特殊說明外，pH調(diào)節(jié)均采用4 mol/L的NaOH溶液自動調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為7.0．

1.2.2 載體處理方法

采用的吸附型載體包括棉纖維織物、PVF柱體、活性炭顆粒．

棉纖維織物預(yù)處理：34 cm(寬)×30 cm(高)棉纖維織物(市售純白色毛巾，厚5 mm，孔隙率>95%，密度0.25 g/cm3，比表面積>40 m2/m3)沸水浴30 min，60 ℃烘箱烘干24 h．將經(jīng)過處理的棉纖維織物鋪放在稍大面積的不銹鋼絲網(wǎng)上，兩者共同以短邊為軸垂直卷成圓筒狀，形成織物層和鋼絲網(wǎng)層交替分布的圓柱體．將圓柱體置于夾套玻璃柱反應(yīng)器(Ф 4 cm×38 cm)內(nèi)，工作(填充)體積355 mL．

PVF柱體預(yù)處理：PVF柱體為Ф 4 cm×12.5 cm圓柱體(密度1.2 g/cm3，孔隙率約為80%，比表面積約為0.5 cm2/g，臺灣長春石化公司)．去離子水浸泡24 h，60 ℃烘箱烘干24 h．夾套玻璃柱反應(yīng)器(Ф 4 cm×38 cm)內(nèi)部填充PVF柱體，工作(填充)體積170 mL．

活性炭顆粒預(yù)處理：20～50目活性炭顆粒(比表面積500～1 000 m2/g，相對密度約1.9～2.1，表觀相對密度約0.08～0.45，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，沖洗粉塵，1 mol/L HCl溶液浸泡24 h，去離子水沖洗，20 g/L NaOH溶液浸泡24 h，去離子水再次沖洗；生理鹽水(9 g/L NaCl)浸泡24 h，60 ℃烘箱烘干24 h．稱取定量材料，牛皮紙包裹于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，60 ℃烘箱烘干．使用時，稱取定量材料(Ф 4 cm×25 cm)裝填入玻璃反應(yīng)柱，工作(填充)體積295 mL．

1.2.3 細胞動態(tài)吸附

夾套玻璃柱反應(yīng)器(Ф 4 cm×38 cm)35 ℃水浴恒溫，通入氮氣保持厭氧環(huán)境．發(fā)酵罐取樣口由軟管與玻璃柱反應(yīng)器連接，初始菌液OD值控制在2.5～3.0．夾套玻璃柱反應(yīng)器內(nèi)部填充任一載體材料，上端加蓋密封．菌液由蠕動泵經(jīng)軟管循環(huán)至玻璃柱反應(yīng)器內(nèi)(見圖1)，循環(huán)流速控制為2 mL/min．在發(fā)酵溫度下動態(tài)吸附4～6 h(或者至進出口OD650值平衡)．

1.2.4 發(fā)酵方法

菌體細胞動態(tài)吸附結(jié)束后，將新鮮補料培養(yǎng)基替換玻璃柱反應(yīng)器及發(fā)酵罐內(nèi)甘油耗盡的發(fā)酵液(見圖1)．將補料培養(yǎng)基連續(xù)補加至玻璃柱反應(yīng)器中，利用蠕動泵控制玻璃柱反應(yīng)器進出口流速及發(fā)酵罐與玻璃柱反應(yīng)器的內(nèi)循環(huán)流速(2 mL/min)，保持發(fā)酵過程中反應(yīng)液體積恒定．操作過程均采用無菌氮氣保持厭氧環(huán)境．

圖1 填充床生物反應(yīng)器操作流程Fig.1 Schematic diagram of operation process for the fixed-bed bioreactor

1.2.5 分析方法

發(fā)酵液搖勻，于650 nm處測定OD值，根據(jù)細胞質(zhì)量濃度和OD的關(guān)系曲線，可推算游離細胞質(zhì)量濃度．OD值與細胞質(zhì)量濃度的換算比例為1OD為細胞質(zhì)量濃度0.48 g/L．

每次取發(fā)酵液10 mL，離心后取上清液于4 ℃保存，稀釋，并用20 nm微孔濾膜過濾3次，采用高效液相色譜(HPLC)分析甘油和1,3-丙二醇的質(zhì)量濃度．

色譜條件為：HPLC Aminex-HPX-87H色譜柱，流動相為0.5 mmol/L的硫酸超純水水溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器．

1,3-丙二醇摩爾得率=1,3-丙二醇生成量/甘油消耗量；1,3-丙二醇時空產(chǎn)率=1,3-丙二醇生成量/(工作體積·發(fā)酵時間)．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同載體對固定化丁酸梭菌連續(xù)發(fā)酵過程的影響

反應(yīng)器內(nèi)的流體流型、傳質(zhì)狀態(tài)和發(fā)酵液的停留時間均與反應(yīng)器中的固定化載體類型有聯(lián)系．本文選取棉纖維織物、PVF柱體、活性炭顆粒這3種常見的吸附型載體作為研究對象，考察不同載體對丁酸梭菌的固定化效果和對固定化丁酸梭菌連續(xù)發(fā)酵過程的影響．將4種連續(xù)發(fā)酵條件下的結(jié)果列于表1和2中．

從表1和2的結(jié)果可知，與游離連續(xù)發(fā)酵相比，以棉纖維織物、活性炭顆粒和PVF柱體為固定化材料的固定連續(xù)發(fā)酵水平都得到顯著提高，因為菌體固定化后可使更多的菌體保留在反應(yīng)器內(nèi)；相比于游離連續(xù)發(fā)酵，反應(yīng)器內(nèi)菌體濃度得到提高，故有效提高了丁酸梭菌代謝甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的水平．

在補料培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間接近的條件下，以棉纖維織物和活性炭顆粒為固定化載體時，甘油幾乎被完全消耗，殘余甘油質(zhì)量濃度接近0，最終1,3-丙二醇的質(zhì)量濃度分別為17.1和13.4 g/L．以活性炭顆粒為固定化載體時，1,3-丙二醇的摩爾得率較高，為61%；以棉纖維織物為固定化載體時，1,3-丙二醇的時空產(chǎn)率較高，為2.4 g/(L·h)．

表1 不同載體下的填充床連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定態(tài)結(jié)果Tab.1 Steady-state results of continuous cultures in the fixed-bed bioreactor at different carriers g/L

注：對照樣為無載體．

在3種固定化載體中，以PVF柱體為固定化載體時，1,3-丙二醇的時空產(chǎn)率最高，為6.3 g/(L·h)；但在其發(fā)酵過程中，泡沫現(xiàn)象嚴重，PVF柱體具有一定的壓縮性，對工業(yè)化生產(chǎn)不利．

以上結(jié)果表明，棉纖維織物和活性炭顆粒較PVF柱體為較優(yōu)的固定化載體，另外，活性炭顆粒較棉纖維織物成本更低且容易裝填，因此后續(xù)研究以活性炭顆粒為固定化載體．

表2 不同載體下的填充床連續(xù)發(fā)酵最終結(jié)果Tab.2 Total results of continuous cultures in the fixed-bed bioreactor at different carriers

注：工作(填充)體積：棉纖維織物355 mL，PVF柱體170 mL，活性炭顆粒295 mL；工作(液體)體積，

對照樣1 500 mL．

2.2 補料培養(yǎng)基中初始甘油質(zhì)量濃度對固定化發(fā)酵的影響

固定化細胞反應(yīng)器能適應(yīng)的底物質(zhì)量濃度和可重復(fù)利用性是衡量一個固定化細胞反應(yīng)器成功與否的重要指標．選用活性炭顆粒作為固定化載體，考察補料培養(yǎng)基的甘油質(zhì)量濃度對固定化丁酸梭菌發(fā)酵的影響．將經(jīng)前處理的活性炭顆粒裝填入反應(yīng)器，操作過程同1.2.2，操作條件見表3(補料培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度不同)，相應(yīng)的連續(xù)發(fā)酵結(jié)果分別見圖2(a)～(c)．

在表3中，操作條件Ⅰ為發(fā)酵罐的菌體培養(yǎng)過程；操作條件Ⅱ 為發(fā)酵罐和玻璃柱反應(yīng)器之間的內(nèi)循環(huán)過程，菌體在此過程中吸附于玻璃柱反應(yīng)器的載體上；操作條件Ⅲ為玻璃柱反應(yīng)器中發(fā)酵液的置換過 程，用新鮮補料培養(yǎng)基替換甘油耗盡的發(fā)酵液；操作條件Ⅳ為玻璃柱反應(yīng)器中補料流加的連續(xù)發(fā)酵過程．

表3 固定化丁酸梭菌的發(fā)酵操作條件Tab.3 Operational conditions for continuous fermentation of glycerol by C. butyricum

圖2 動態(tài)吸附、置換及連續(xù)發(fā)酵曲線 Fig.2 The curves of cell adsorption to carbon granules,replacement of medium,continuous fermentation

由圖2(a)可以看出，發(fā)酵液中殘余甘油質(zhì)量濃度較高，可能原因是發(fā)酵液中產(chǎn)物和副產(chǎn)物的抑制作用，使菌體活性下降．

由于補料培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度較高，圖2(a)中發(fā)酵結(jié)束時甘油的殘留量較高，因此，將補料培養(yǎng)基中的甘油質(zhì)量濃度降至20 g/L，其他操作條件見表3(b)．

注：工作(填充)體積為295 mL．

由圖2(b)可見，連續(xù)發(fā)酵過程中情況較為穩(wěn)定，游離細胞、甘油、1,3-丙二醇的質(zhì)量濃度均略有下降，丁酸和乙酸的質(zhì)量濃度變化均較?。谶B續(xù)發(fā)酵開始時甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，固定化丁酸梭菌可將甘油徹底轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇．

由于補料培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度較低，圖2(b)中的發(fā)酵結(jié)束時，雖然底物完全消耗，但1,3-丙二醇的最終質(zhì)量濃度較低，因此，將補料培養(yǎng)基中的甘油質(zhì)量濃度折中調(diào)整為135 g/L，其他操作條件見表3(c)．

綜合以上(補料培養(yǎng)基中初始甘油質(zhì)量濃度、殘余甘油質(zhì)量濃度、1,3-丙二醇最終質(zhì)量濃度、1,3-丙二醇摩爾得率、1,3-丙二醇時空產(chǎn)率等)結(jié)果，得出表4．

由表4中的結(jié)果可以看出，補料培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度越低，殘余甘油質(zhì)量濃度越低．當甘油質(zhì)量濃度為20 g/L時，甘油基本完全消耗；為252 g/L時，殘余甘油質(zhì)量濃度96.3 g/L，約為135 g/L時的2倍．

當初始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L時，1,3-丙二醇的摩爾得率最高，但1,3-丙二醇的時空產(chǎn)率最低，為135 g/L時的54%，為252 g/L時的32%．同時，當甘油質(zhì)量濃度為20 g/L時，1,3-丙二醇最終質(zhì)量濃度最低，為135 g/L時的43%，為252 g/L時的25%．

以上結(jié)果表明，補料培養(yǎng)基的甘油質(zhì)量濃度對固定化連續(xù)發(fā)酵有較大的影響，甘油質(zhì)量濃度越高，1,3-丙二醇的質(zhì)量濃度和時空產(chǎn)率也隨之升高，但殘余甘油質(zhì)量濃度也越高；對1,3-丙二醇的摩爾得率影響不大，但有降低趨勢．

3 結(jié) 論

本文采用活性炭顆粒作為丁酸梭菌固定化載體發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇，同條件下，1,3-丙二醇連續(xù)發(fā)酵時空產(chǎn)率1.9 g/(L·h)遠高于無載體時的0.3 g/(L·h)，說明該方法可有效穩(wěn)定細胞活性；殘余甘油質(zhì)量濃度0.1 g/L遠低于無載體時的30.0 g/L，1,3-丙二醇質(zhì)量濃度13.4 g/L遠高于無載體時的2.8 g/L，說明該方法可提高細胞對底物的利用率及對產(chǎn)物的耐受性；最后，采用固定化方法可降低產(chǎn)物后期處理工序難度．與Zhao等[11]利用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋克雷伯氏肺炎桿菌進行補料分批發(fā)酵相比，本文采用的固定化載體成本低廉，便于操作．補料培養(yǎng)基的甘油質(zhì)量濃度對固定化連續(xù)發(fā)酵有較大影響，甘油質(zhì)量濃度越高，殘余甘油質(zhì)量濃度就越高，1,3-丙二醇的質(zhì)量濃度和時空產(chǎn)率也隨之升高，但對1,3-丙二醇摩爾得率影響不大．綜上，我們將更廣泛地研究多類適用于工業(yè)化的固定化載體，對反應(yīng)器、培養(yǎng)基、反應(yīng)條件等多方面進行優(yōu)化綜合，最終提高工業(yè)化生產(chǎn)1,3-丙二醇的摩爾得率和時空產(chǎn)率．

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