閻春蘭，代金剛，王恒濤，邱裕堯，王 茜

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430074)

黑色素是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，顏色從棕色到黑色，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的非均質(zhì)類多酚聚合體.這種色素并非對(duì)生物的生長(zhǎng)和發(fā)育必不可少，但卻能夠提高生物的生存和競(jìng)爭(zhēng)能力[1].黑色素應(yīng)用潛力巨大，作為紫外線吸收劑、自由基清除劑、抗氧化劑、無(wú)定形的半導(dǎo)體、生物殺蟲劑的光保護(hù)劑和新型的天然藥物載體，可用于治療某些與黑色素缺乏有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病.近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些可溶性黑色素在體外對(duì)艾滋病病毒有顯著的抑制作用，使天然黑色素可望成為一種新的抗艾滋病藥物[2，3].

為獲得高產(chǎn)胞外黑色素的優(yōu)良菌株，本文從土壤中分離篩選得到一株產(chǎn)黑色素鏈霉菌，并研究和鑒定了其產(chǎn)黑色素性質(zhì)和部分生理生化特征，為后期優(yōu)化產(chǎn)黑色素的條件提供了良好的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所用土壤來(lái)自中南民族大學(xué)校園.培養(yǎng)基：采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2). pMD18-T載體、Taq聚合酶(Takara公司)，T4 DNA連接酶(MBI生物公司)，16S rDNA 的測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志公司).UV757CRT紫外可見分光光度計(jì)(UV757CRT，上海精密科學(xué)儀器有限公司). PCR儀(T-personal 48, Biometra公司).

1.2 方法

土壤中的微生物采用稀釋涂布平板法，對(duì)稀釋涂布平板法得到的單菌落，通過(guò)平板劃線分離法進(jìn)行純化.將純化的菌體振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，抽提基因組DNA. PCR擴(kuò)增菌體基因組16S rDNA.引物16S-F： 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物16S-R ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′.PCR程序參考文獻(xiàn)[4]，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)用瓊脂糖凝膠回收后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞.通過(guò)Blast程序，將由北京三博遠(yuǎn)志公司所測(cè)得的16S rDNA 序列與 GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA 序列進(jìn)行相似性比較分析，選取同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.采用Mega 2.0程序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析.

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株按5%接種到30 mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)，分別在0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h 后，離心取樣，將沉淀在55℃烘干至恒重，稱量干重后，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線.

采用四環(huán)素(Tc)、氨芐青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)、慶大霉素(Gm)、鏈霉素(St)、壯觀霉素(Sp)、氯霉素(Cm)共7種抗生素對(duì)細(xì)菌的抗生素抗性進(jìn)行了測(cè)定. 利用發(fā)酵液在UV757CRT紫外可見分光光度計(jì)上于200～800 nm內(nèi)掃描測(cè)定菌株所產(chǎn)黑色素的吸收光譜[5]. 參照文獻(xiàn)[6]測(cè)定菌株所產(chǎn)黑色素的抗輻射能力.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征與鑒定

經(jīng)稀釋涂布平板法分離、平板劃線純化后，從土壤中得到了4株產(chǎn)黑色素的菌株，其中D-1產(chǎn)黑色素能力較強(qiáng)(見圖1).D-1在培養(yǎng)基上菌落表面成粉末狀，干燥、不透明、邊緣整齊，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，難于挑取.鏡檢結(jié)果為絲狀體，有孢子.

1) 產(chǎn)黑色素的菌液; 2) 未接種菌株的培養(yǎng)基圖1 菌株D-1產(chǎn)黑色素的菌液Fig.1 Bacterial liquid of melanin-producing microorganism D-1

將D-1菌株的16S rDNA部分序列與Genbank基因庫(kù)中已知的16S rDNA序列同源性比較發(fā)現(xiàn)：菌株D-1與Streptomyces鏈霉菌屬的多個(gè)菌株的序列相似性均達(dá)到了99%以上.

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖2)可見，從GenBank中搜索得到與D-1同源性在99%以上的12個(gè)菌株中，D-1屬于Streptomyces鏈霉菌屬，但與其他鏈霉菌屬菌株存在較大差異.結(jié)合菌株的形態(tài)和16S rDNA 部分序列的比對(duì)結(jié)果，確定菌株D-1屬于鏈霉菌屬(Streptomyces).在系統(tǒng)發(fā)育地位上則屬于：Bacteria，Actinobacteria，Actinobacteria，Actinomycetales，Aptomycetaceae，Streptomyces.

圖2 菌株D-1的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of D-1 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株的黑色素的紫外可見光吸收光譜

將菌株所產(chǎn)生的黑色素菌液經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋后在紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行200～800 nm區(qū)間吸收峰的連續(xù)掃描，掃描結(jié)果見圖3.由圖3可見，菌株所產(chǎn)黑色素在240～250nm處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，在可見光區(qū)域內(nèi)沒有特征吸收峰，吸收度隨波長(zhǎng)的增大而減少，與文獻(xiàn)報(bào)道的黑色素的吸收光譜相吻合[5].

λ/nm圖3 菌株D-1所產(chǎn)黑色素的紫外-可見光吸收光譜Fig.3 The absorption spectrum of melanin produced by D-1

2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

37℃下將菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，分別在0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h 后離心取樣，將沉淀在55℃烘干至恒重，稱量干重后繪制生長(zhǎng)曲線如圖4.由圖4可見，菌株在12～48h之間生長(zhǎng)迅速，在約48 h進(jìn)入平臺(tái)期，隨后細(xì)胞數(shù)量略有所下降.

圖4 菌株D-1的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of strain D-1

2.5 抗生素抗性的測(cè)定

采用多種抗生素對(duì)菌株D-1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1.由表1可見，St50、Km20、Sp10、Gm5對(duì)D-1均有很好的抑制作用，即終濃度分別為50 μg·mL-1的鏈霉素、20 μg·mL-1的卡那霉素、10 μg·mL-1的壯觀霉素、5 μg·mL-1的慶大霉素均能抑制這種微生物的生長(zhǎng)，而2 μg·mL-1的四環(huán)素和氯霉素對(duì)該菌均無(wú)抑制作用，20 μg·mL-1的氨芐青霉素對(duì)該菌具有部分的抑制作用.

表1 菌株D-1的抗生素抗性

-: 菌種不能生長(zhǎng); +: 菌種可以生長(zhǎng)

2.6 黑色素對(duì)菌株的保護(hù)作用

以常見菌種大腸桿菌為檢測(cè)菌，測(cè)定了D-1所產(chǎn)的黑色素對(duì)紫外線的抗輻射能力，結(jié)果見圖5.由圖5可見，紫外線照射5 min 后，對(duì)照組中大腸桿菌被殺死的達(dá)到88.72 %，僅11.28 %存活，而加入了D-1所產(chǎn)黑色素的大腸桿菌，大腸桿菌被殺死的僅為6.84 %，有93.16 %的大腸桿菌存活；紫外線照射10 min 后，對(duì)照組中95 %的大腸桿菌被殺死，處理組中仍有接近16 %的大腸桿菌存活.紫外線照射15 min 后，對(duì)照組中的大腸桿菌存活的僅為0.5 %，處理組中還有7.88 %的大腸桿菌存活.由此可見，D-1所產(chǎn)的黑色素可抵抗紫外線的輻射作用，使得被測(cè)菌株的存活率明顯提高.這與蔡信之[6]將含有嗜麥芽假單胞菌酪氨酸酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入類產(chǎn)堿假單胞菌中獲得的重組子所產(chǎn)生的黑色素的抗輻射能力相當(dāng).

圖5 紫外線照射下不同時(shí)間的菌體存活率 Fig.5 Survival rates of bacterium by radiating of ultraviolet rays in different time

3 結(jié)語(yǔ)

黑色素應(yīng)用潛力巨大，從動(dòng)物或植物體內(nèi)提取黑色素，因生產(chǎn)過(guò)程繁瑣、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)難以大規(guī)模生產(chǎn)，而微生物資源豐富，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，故利用微生物發(fā)酵黑色素技術(shù)的研究越來(lái)越得到重視.本文從土壤中分離得到了一株產(chǎn)黑色素的菌株，其所產(chǎn)黑色素的吸收光譜與多篇文獻(xiàn)報(bào)道的黑色素的吸收光譜相吻合，具有明顯的保護(hù)作用，可保護(hù)機(jī)體免受紫外線的輻射傷害.根據(jù)菌株的形態(tài)特征并結(jié)合16S rDNA序列比對(duì)分析確定該菌株為屬于鏈霉菌屬(Streptomyces).本文為后期優(yōu)化產(chǎn)黑色素的條件提供了理論基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 陳雪峰, 蘇桂鋒, 周慶禮. 我國(guó)黑色素微生物資源的研究現(xiàn)狀[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(6) : 318-320.

[2] 李建波, 宋 欣, 曲音波. 產(chǎn)胞外黑色素菌株的篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31(1): 50-54.

[3] Langfelder K, Streibel M, Jahn B, et al. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pahtogenic fungi [J]. Fungal Genet Biol, 2003 (38): 143-158.

[4] 程國(guó)軍，楊 凱，李友國(guó).一株降解苯酚微生物的分離與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47(2)：792-793.

[5] 葉 明,許慶平,陳 曉,等. LachnumYM-223 產(chǎn)黑色素發(fā)酵及其黑色素抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 185-189.

[6] 蔡信之. 類產(chǎn)堿假單胞菌酪氨酸酶基因重組子所產(chǎn)黑色素性質(zhì)的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41(6): 699-703.