耿 紅，劉劍鋒，王 諾

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

隨著重工業(yè)的飛速發(fā)展，我國(guó)不少水域被重金屬污染.重金屬污染不僅嚴(yán)重影響淡水生態(tài)系統(tǒng)，且易由食物鏈產(chǎn)生生物積累和放大效應(yīng).重金屬經(jīng)各種途徑進(jìn)入水體后，藻類生物是首要受害者.藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要成分之一，它對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響.對(duì)重金屬對(duì)藻類的致毒效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)研究報(bào)道，但存在爭(zhēng)議，且有關(guān)重金屬對(duì)藻類的代謝研究較少[1-3].

本文選取普通小球藻(Chlorellavulgaris)為實(shí)驗(yàn)藻種，研究了水體污染中常見(jiàn)的重金屬汞和鎘對(duì)該藻種生長(zhǎng)及其相關(guān)生理生化特性如葉綠素和蛋白質(zhì)含量等的影響，初步探討了汞和鎘對(duì)普通小球藻影響的生理機(jī)制，以為水體重金屬污染監(jiān)測(cè)和治理提供一定的理論參考.

1 材料和方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

普通小球藻(C.vulgaris)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，使用HB-4培養(yǎng)基置于(25±1)℃ 的GZX - 250 BS - III 型光照培養(yǎng)箱內(nèi)持續(xù)充氣培養(yǎng)備用，光照強(qiáng)度為100 μE/(m2·s)，光周期為12 L︰12 D.

1.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由分析純HgCl2和CdCl2·2H2O配制0, 0.05,0.1,0.5,1.0,2.0 mg/L不同濃度的Hg2+和Cd2+，將0 mg/L作為對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)前先配制100×母液，抽濾后置于4℃冰箱中備用，用前加入，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)平行.

實(shí)驗(yàn)時(shí)先將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種至80 mL培養(yǎng)基中，起始A680約為0.05.培養(yǎng)24 h后，取少量藻液，在顯微鏡下通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞密度計(jì)數(shù)，并在波長(zhǎng)680 nm下測(cè)定藻吸光度A680，建立不同藻細(xì)胞密度與吸光度間的線性關(guān)系.之后每隔24 h，取各濃度少量藻液測(cè)定其吸光度A680. 用乙醇抽提葉綠素[4]，計(jì)算葉綠素(含葉綠素a 和葉綠素b)總含量：葉綠素濃度(mg/L)=(A625× 1000)/34.5.取培養(yǎng)到第6 d的小球藻液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其可溶性蛋白含量.用SPSS 18.0重復(fù)測(cè)量資料的方差分析法分析Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻的生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 Hg2+、Cd2+對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)在開(kāi)始前對(duì)藻液進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)和分光光度測(cè)定2種方法，以衡量吸光度值與藻細(xì)胞密度間的關(guān)系，結(jié)果顯示吸光度值與藻細(xì)胞密度(cells/mL)有良好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖1)，線性回歸方程為：y= 0.0666x+ 0.0032，R2= 0.9974，故實(shí)驗(yàn)中采用分光光度法測(cè)定普通小球藻數(shù)量.

藻細(xì)胞密度/(106·mL-1) 圖1 藻細(xì)胞密度與吸光度間的關(guān)系 Fig.1 Relationship between algae cell density and its absorbance at 680 nm

不同濃度Hg2+、Cd2+處理下普通小球藻的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2.由圖2a可見(jiàn)低濃度Hg2+(0.05～0.50 mg/L)處理組的小球藻生長(zhǎng)比對(duì)照組好；當(dāng)Hg2+濃度增大到1.00 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)減慢，后期甚至開(kāi)始死亡，在第5天達(dá)到最大生物量，OD平均值為0.138，僅為對(duì)照組的62.44 %；當(dāng)Hg2+濃度繼續(xù)增大為2 mg/L時(shí)，小球藻呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的生物量較最初時(shí)下降了30.77%.由圖2b可見(jiàn)，Cd2+對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響也呈現(xiàn)類似的規(guī)律.當(dāng)Cd2+濃度為0～0.50 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)速率隨著Cd2+濃度的增加而增大；當(dāng)Cd2+濃度增加到1.00 mg/L時(shí)，小球藻增長(zhǎng)明顯變緩；當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到2 mg/L時(shí)，小球藻幾乎不生長(zhǎng)直至死亡.方差分析結(jié)果顯示：不同濃度的Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)有極顯著影響(p<0.01).

t/d t/d a) Hg2+；b) Cd2+ 圖2 Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the growth of Chlorella vulgaris

2.2 Hg2+、Cd2+對(duì)小球藻葉綠素含量的影響

Hg2+、Cd2+對(duì)普通小球藻葉綠素含量的影響見(jiàn)圖3.由圖3a可見(jiàn)，低濃度Hg2+(0～0.10 mg/L)能促進(jìn)小球藻葉綠素含量的增加，第6天，0.05, 0.10 mg/L Hg2+處理下的小球藻葉綠素含量比對(duì)照組分別增加了14.73%，26.74%.當(dāng)Hg2+濃度增大至1 mg/L時(shí)，小球藻的葉綠素合成出現(xiàn)明顯抑制，葉綠素含量幾乎無(wú)增長(zhǎng)；2 mg/L Hg2+處理下的小球藻葉綠素含量下降速度更快，第6天，葉綠素含量比對(duì)照組減少了94.57%，與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始相比下降了87.61%.圖3b為Cd2+對(duì)普通小球藻葉綠素含量的影響，在0 ～ 0.5 mg/L的Cd2+濃度范圍內(nèi)，小球藻的葉綠素含量隨著Cd2+濃度的增加而增加；當(dāng)Cd2+濃度增加到1mg/L時(shí)，葉綠素的含量明顯低于對(duì)照組，其增長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)鐘罩型，在實(shí)驗(yàn)第3天達(dá)到葉綠素含量的最大值(1.246 mg/L)；2 mg/L Cd2+處理下的小球藻葉綠素含量呈負(fù)增長(zhǎng)，第6天較對(duì)照組下降了87.14%.方差分析結(jié)果顯示不同濃度的Hg2+和Cd2+對(duì)小球藻葉綠素含量有極顯著影響(p<0.01).

t/d t/da) Hg2+；b) Cd2+圖3 Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the chlorophyll content of Chlorella vulgaris

2.3 Hg2+、Cd2+對(duì)小球藻蛋白質(zhì)含量的影響

Hg2+、Cd2+對(duì)小球藻蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖4. 由圖4可見(jiàn)，普通小球藻蛋白質(zhì)含量隨著Hg2+、Cd2+濃度的增加先增加后減少，0.1 mg/L Hg2+處理下的小球藻蛋白質(zhì)含量值最大，為26.89 μg/mL；而Cd2+處理下的小球藻蛋白質(zhì)含量則是在Cd2+濃度為0.5 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，為15.84 μg/mL.當(dāng)Hg2+、Cd2+濃度增加到1 mg/L時(shí)，小球藻蛋白質(zhì)合成明顯抑制；當(dāng)濃度進(jìn)一步增大到2 mg/L時(shí)，則藻液中無(wú)蛋白質(zhì)積累.方差分析結(jié)果顯示不同濃度的Hg2+和Cd2對(duì)普通小球藻蛋白質(zhì)含量有顯著影響(p<0.01).

ρ/(mg·L-1)圖4 Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of Hg2+ and Cd2+ on the content of protein of Chlorella vulgaris

3 討論

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量的最基本方法，也是判斷其他測(cè)定方法有效性的依據(jù)，其操作簡(jiǎn)單，但工作量大，重現(xiàn)性不好，易破壞樣品，人為因素影響大，誤差大；分光光度法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速，不易破壞樣品，人為誤差較小.本研究通過(guò)對(duì)2種方法的比較發(fā)現(xiàn)通過(guò)分光光度法測(cè)定的吸光度值與細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到的藻細(xì)胞密度間有較好的相關(guān)性，故采用分光光度法來(lái)描述普通小球藻(C.vulgaris)生長(zhǎng)狀態(tài)的變化.此外，研究表明，細(xì)胞生長(zhǎng)的前期主要利用培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分裂繁殖，增加生物量，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗將盡，生物量積累到一定程度后，細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)的平衡期，此時(shí)開(kāi)始積累大分子代謝產(chǎn)物，胞內(nèi)蛋白主要在此期間進(jìn)行[5].故本實(shí)驗(yàn)中選取進(jìn)入平衡期的藻液用于分析細(xì)胞里的蛋白質(zhì)含量.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度(0 ～ 0.50 mg/L)Hg2+和Cd2+能促進(jìn)普通小球藻的生長(zhǎng)、葉綠素和蛋白質(zhì)合成，是由于Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻的“毒性興奮效應(yīng)”[2].Calabrese歸納了1998年以前的8500多個(gè)研究，發(fā)現(xiàn)共有350個(gè)研究，計(jì)593次實(shí)驗(yàn)報(bào)告了低劑量刺激效應(yīng)[6].當(dāng)Hg2+和Cd2+濃度增加到1 mg/L時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，葉綠素含量減少，蛋白質(zhì)合成量陡降；當(dāng)重金屬濃度增大至2 mg/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量幾乎為零，小球藻開(kāi)始大量死亡.這是因?yàn)楦邼舛鹊腍g2+和Cd2+超出了細(xì)胞所需和細(xì)胞正常調(diào)節(jié)所耐受的濃度范圍，使光合作用系統(tǒng)受到不可修復(fù)的破壞，令葉綠素酶活性失調(diào)，葉綠素分解加快，抑制了葉綠素的合成[2].趙瑾等[3]研究表明重金屬可通過(guò)破壞藻細(xì)胞的捕光天線系統(tǒng)，阻斷藻膽蛋白對(duì)光電子的捕獲和傳遞，從而抑制光合作用，最終抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致藻類生物量的不斷降低.大量的Cd2+進(jìn)入藻細(xì)胞后干擾了離子間原有的平衡系統(tǒng)，造成離子的吸收、運(yùn)輸、滲透和調(diào)節(jié)等方面的障礙，使葉綠素含量下降、蛋白質(zhì)合成受到抑制[2].

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)Hg2+和Cd2+濃度均增至2 mg/L時(shí)，小球藻第6天的生物量較對(duì)照組分別下降了81.85 %和91.67 %，葉綠素含量則分別下降了94.57%和87.19 %，由此可見(jiàn)，Hg2+和Cd2+對(duì)普通小球藻的毒性差異隨所測(cè)定指標(biāo)的不同而有所不同.吳振斌等[7]研究結(jié)果顯示Hg2+對(duì)伊樂(lè)藻(Elodea nuttallii)的毒性約為Cd2+的4倍，但不同植物對(duì)金屬離子的毒性反應(yīng)順序可能有變化，劉益浩[8]研究也表明藻在重金屬離子下的暴露時(shí)間對(duì)毒性的高低也有影響.

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 閻 海,潘 綱,霍潤(rùn)蘭. 銅、鋅和錳抑制月形藻生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2001，21(3): 328-332.

[2] 閻春蘭,丁華堆. 鎘對(duì)集胞藻PCC6803生長(zhǎng)的影響[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008, 27(4): 34-36.

[3] 趙 瑾,常學(xué)秀,吳 程,等. Ni2+脅迫對(duì)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)和集胞藻(Synechocystissp.)的生長(zhǎng)和光合色素的影響 [J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2010, 5(5): 679-684.

[4] 岳霞麗,張新萍,胡先文,等.芐嘧磺隆對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)效應(yīng)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(9): 1823-1827.

[5] 楊海波,于 媛,劉 艷,等. 營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)小球藻生長(zhǎng)及胞內(nèi)蛋白質(zhì)和多糖含量的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2004, 23(1): 6-9.

[6] Calabrese E J. Hormesis: principles and applications for pharmacology and toxicology [J].Am J Pharmacol Toxicol, 2008, 3(1): 59-71.

[7] 吳振斌,馬劍敏,趙 強(qiáng),等. Hg2+、Cd2+及其復(fù)合脅迫對(duì)伊樂(lè)藻的毒害[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2005,25(3): 262-266.

[8] 劉益浩. 斜生柵藻與重金屬的相互作用研究[D] .南京：河海大學(xué), 2007.