束薇薇，邵東華，杭黎華，濮健峰，高輝德

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

七氟醚預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠T細胞死亡耦聯基因8表達的影響

束薇薇，邵東華，杭黎華，濮健峰，高輝德

（江蘇大學附屬人民醫(yī)院麻醉科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：觀察七氟醚預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內T細胞死亡耦聯基因8（TDAG8）表達的影響。方法：選取54只成年雄性SD大鼠，隨機分為對照組、再灌注組和七氟醚組，每組18只。采用大腦中動脈內線栓阻斷法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。缺血2 h后再灌注48 h。七氟醚組在造模前吸入最低肺泡有效濃度（MAC）為1的七氟醚30 min，對照組和再灌注組則吸入O2。大鼠行神經行為學評分后處死。取大腦行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，計算腦梗死容積百分比，采用蛋白印跡法和RT-PCR法檢測腦缺血半暗帶內的TDAG8蛋白和mRNA的表達變化。結果：①與對照組相比，再灌注組和七氟醚組腦梗死容積百分比均顯著升高（P均＜0.05）；七氟醚組腦梗死容積百分比較再灌注組顯著降低（P＜0.05）。②與對照組相比，再灌注組和七氟醚組TDAG8蛋白和mRNA表達均顯著升高（P均＜0.05）；七氟醚組較TDAG8的表達再灌注組明顯降低（P＜0.05）。結論：七氟醚預處理可降低TDAG8的表達，對腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用。

七氟醚；預處理；腦缺血再灌注；T細胞死亡耦聯基因8；大腦中動脈內線栓阻斷法

七氟醚是新型鹵代烴基醚類揮發(fā)性吸入麻醉藥，臨床應用具有蘇醒快、刺激小，既能增加腦血流量，又能保留中樞自主調節(jié)等特點。徐仲煌等［1］研究表明，七氟醚預處理可增加腦血流量、降低腦代謝率，從而對腦組織起到保護作用。T細胞死亡耦聯基因8（T cell death-associated gene 8，TDAG8）是新近發(fā)現的一種G蛋白耦聯的受體，也稱為G蛋白耦聯受體65［2－3］。本課題組前期研究表明［4］，TDAG8參與腦缺血再灌注損傷。本研究旨在研究七氟醚預處理對缺血半暗帶TDAG8表達的影響，以進一步探討TDAG8在腦缺血再灌注損傷中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大腦中動脈內線栓阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（北京沙東生物技術有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma公司），Trizol（Invitrongen公司），cDNA反轉錄試劑盒（TaKa-Ra公司），PCR儀、SsoFast（Bio-Rad公司），兔多克隆抗G蛋白偶聯受體65（Abcam公司），β-肌動蛋白單克隆抗體（Bioworld公司），山羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術有限公司），PVDF膜（GE healthcare公司），DAB顯色劑（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。

1.2 動物及分組

健康成年雄性SD大鼠54只，購自江蘇大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2008-0024，體質量250～280 g，隨機分為對照組、再灌注組和七氟醚組，每組18只。我們前期已證實假手術組TDAG8表達與正常組比較差異無統計學意義［4］，故本研究未設假手術組。

1.3 模型的制作

參照Longa等［5］大鼠MCAO法加以改良構建大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。用2%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術臺上，于頸部正中切開，逐層分離組織，顯露左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。結扎頸總動脈、頸外動脈，在頸內動脈上套一根線打一活結并用血管鉗夾住線的末端，將此線往外側輕拉頸內動脈（防止頸總動脈破裂后血液急劇流出）；于頸總動脈分叉下方剪一切口，將一線栓置入頸內動脈17～18 mm，直到有輕微阻力感為止，扎緊活結固定線栓后全層縫合皮膚。缺血2 h后抽出線栓，恢復灌注（對側半球血流經Wills環(huán)供血）。對照組不做處理，正常喂養(yǎng)。再灌注48 h后，先行神經行為學評分，隨后處死大鼠。實驗過程及大鼠蘇醒期間均保持大鼠體溫正常（實驗過程中予以電燈泡照射，保持體溫37℃±0.5℃），監(jiān)測肛溫、呼吸及心跳。

1.4 分組處理

七氟醚組在缺血再灌注30 min前，預先吸入最低肺泡有效濃度（MAC）為1的七氟醚。將實驗大鼠置于一半密閉的有機玻璃盒內，體積約30 cm× 30 cm×25 cm，設有進出氣孔各一，通過麻醉氣體揮發(fā)罐持續(xù)輸入含有2%七氟醚的O2，4 L／min，燈泡加熱，維持盒內溫度為35～37℃，避免大鼠體溫在麻醉過程中下降。盒底鋪上鈉石灰，使PCO2＜50 kPa（0.05標準大氣壓）。大鼠保留自主呼吸。

對照組和再灌注組在缺血再灌注30 min前，吸入O2（4 L／min），其他同七氟醚組。

1.4.1 觀察指標 動物恢復及神經功能損害評估：麻醉蘇醒后，將動物放回鼠籠，自由飲食。腦缺血-再灌注后，由一不了解分組情況的觀察者評估記錄神經功能障礙評分，方法參考文獻［5］，即6級評分法：0分，無功能障礙；1分，不能伸展右側前肢；2分，向右側旋轉；3分，向右側傾倒；4分，無自主活動伴意識障礙；5分，死亡。

1.4.2 造模成功的標準 神經功能障礙評分為1～3分，取腦時蛛網膜下腔無出血。

1.5 TTC染色及腦梗死灶測量

完成大鼠神經功能障礙評分后，行2%戊巴比妥鈉深麻醉，斷頭處死。迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10 min，取冠狀面，均勻切片2 mm，迅速放入2% TTC溶液（37℃）中染色30 min，然后用10%甲醛液固定。24 h后用數碼相機（KODAK，DC240）將切片拍照，輸入計算機，用圖像處理軟件（ADOBE PHOTOSHOP 5.0）計算梗死容積（粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為腦梗死組織）百分比，即梗死灶占對側正常大腦半球的百分比。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測TDAG8 mRNA

腦缺血半暗帶的范圍為冠狀面距額極7～11 mm，缺血側大腦縱裂到大腦外側溝皮層上1／3并去除縱裂內切1 mm的組織區(qū)域（大腦前動脈供血）。

Trizol抽提大鼠缺血半暗帶總RNA，測定其濃度，進行反轉錄。cDNA的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TDAG8引物長度為199 bp，引物序列：上游5′-CATTTTAGAGCGCAACGTGA-3′，下游5′-TTGTCCTCGGGATCTATTGC-3′。選用β-肌動蛋白作為內參，其引物長度為207 bp，引物序列：上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′；下游5′-CCC ATACCCACCATCACACC-3′。采用實時定量PCR法，將cDNA產物從56℃緩慢提升到95℃，每升高0.2℃讀1次熒光值，共40個循環(huán)后進行熔解曲線分析。以β-肌動蛋白的表達量為參照標準，按照2－△△Ct計算TDAG8 mRNA相對表達量。

1.7 蛋白質印跡法檢測TDAG8蛋白的表達

提取各組大鼠缺血半暗帶腦組織總蛋白，采用Bradford法進行蛋白定量后行SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜。一抗（兔多克隆抗G蛋白偶聯受體65，1∶5 000）孵育過夜，洗滌后加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶5 000），室溫孵育1 h，洗滌后用Bio-Rad顯色，掃描并用凝膠圖像處理系統分析目的條帶的相對分子質量和凈光密度值，以各蛋白與內參β-肌動蛋白的比值表示蛋白的相對表達水平。

1.8 統計學方法

用SPSS 19.0統計學軟件處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死容積百分比

與對照組相比，再灌注組和七氟醚組腦梗死容積百分比均顯著升高（F＝375.071，P＜0.001）；七氟醚組腦梗死容積百分比較再灌注組顯著降低（t＝4.023，P＜0.01）。見圖1。

2.2 腦缺血半暗帶內TDAG8 mRNA及蛋白的表達

與對照組相比，再灌注組和七氟醚組TDAG8 mRNA及蛋白表達均顯著升高（P均＜0.001），且七氟醚組TDAG8 mRNA表達和蛋白表達明顯低于再灌注組（t分別為4.459，5.431；P值分別為0.015，0.001 7）。見表1，圖2。

圖1 各組腦組織TTC染色圖

表1 各組大鼠腦缺血半暗帶內TDAG8 mRNA及蛋白的相對表達量 x－±s

圖2 大鼠腦缺血半暗帶內TDAG8蛋白的表達

3 討論

近來研究顯示，吸入麻醉藥預處理，可以模擬缺血預處理，減輕腦缺血再灌注損傷。研究證實，在成年嚙齒類動物永久或短暫局灶性腦缺血模型中，異氟醚或七氟醚預處理能顯著減少腦梗死面積，改善缺血后神經功能的恢復［6－7］。Payne等［8］在全腦缺血動物模型研究中證實，1 MAC的七氟醚具有腦保護作用，并且一次給予七氟醚30 min已經足夠誘導早期預處理對全腦缺血的保護作用。所以本實驗采用在缺血再灌注前預先吸入1 MAC的七氟醚30 min進行預處理。鑒于大鼠腦缺血2 h后梗死灶趨于穩(wěn)定［9］，我們之前的實驗將大鼠分為5組，分別為對照組，缺血再灌注6、12、24、48 h組，實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠缺血半暗帶內TDAG8的表達，結果顯示，再灌注48 h時，缺血半暗帶內TDAG8的表達最高（未發(fā)表）。所以本實驗分為對照組、再灌注組和七氟醚組，其中七氟醚組在缺血再灌注前預先吸入1 MAC七氟醚30 min。

TDAG8在T淋巴細胞程序性死亡過程中高表達，表明其可能參與活化誘導T細胞死亡，因此得名［2－3］。TDAG8主要存在于外周血白細胞、脾臟、淋巴結、胸腺組織中［10］，另外在正常大鼠腦組織，如杏仁核、下丘腦、海馬、額皮質、紋狀體等部位，也有明顯表達［11］。TDAG8屬于7次跨膜的G蛋白耦聯受體，由α、β、γ3個亞基組成異源三聚體。根據α亞基可將G蛋白分為Gi、Gs、Gq、G12／13等型。G蛋白的分子構象有結合GDP的失活態(tài)和結合GTP的激活態(tài)2種。激活態(tài)的G蛋白可激活下游的效應器，如腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和磷脂酶A2等，進而催化生成（或分解）第二信使，通過激活蛋白激酶A、C等通路來調控活化的T細胞核因子的表達。Wang等［12］研究結果顯示，七氟醚通過激活腺苷A1受體，進而激活Gi蛋白及蛋白激酶C，再激活線粒體和肌纖維膜上的ATP敏感性鉀通道以及有絲分裂原活化的蛋白激酶；ATP敏感性鉀通道可通過縮短動作電位和減少鈣離子的流入來發(fā)揮心肌保護作用，提示七氟醚也可通過該途徑發(fā)揮對腦的保護作用。由于胞內各條信號通路并不是完全孤立存在，而是相互影響相互“對話”（cross-talk），所以，我們推測七氟醚對TDAG8表達的下調可能是通過某條或幾條信號通路來調控的，但具體機制還有待進一步研究。

本實驗結果顯示，七氟醚組較再灌注組腦梗死容積百分比顯著降低，提示七氟醚預處理后能顯著減小腦梗死體積，對腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用。從基因表達和蛋白質表達這兩方面發(fā)現，七氟醚處理后腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內TDAG8 mRNA和蛋白表達均明顯下降，且接近于未缺血再灌注損傷水平。由此得出，七氟醚預處理降低了TDAG8在損傷腦組織中的表達，結合TDAG8在再灌注組中的高表達，我們推測TDAG8在腦組織再灌注后會加劇其損傷程度。

總之，本實驗結果表明TDAG8在腦缺血再灌注損傷中可能起損傷作用，而七氟醚預處理對其損傷具有保護作用。

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Effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8 follow ing focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats

SHUWei-wei，SHAO Dong-hua，HANG Li-hua，PU Jian-feng，GAO Hui-de

（Department of Anesthesiology，Affiliated People′s Hospital，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To observe the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8（TDAG8）in the penumbra of rat cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion injury.M ethods：Fifty-four adult male SD rats were equally randomly divided into three groups：control group，reperfusion group and sevoflurane group.The focal cerebral ischemia-reperfusionmodelswere established bymiddle cerebral artery occlusion（MCAO）method.The reperfusion group and sevoflurane group were reperfused for 48 h after ischemia for 2 h.In sevoflurane group the rats inhaled 1 MAC sevoflurane for 30 min before MCAO，while control group and reperfusion group inhaled oxygen.After neurological function appraising，all animals were killed.Infarct volume，as a percentage of volume at normal cerebral hemisphere，was determined by 2，3，5-triphenylte-trazolium（TTC）staining and real-time PCR；Western blotting were used to detect the levels ofmRNA and protein expression of TDAG8.Results：①Compared with the control group，the infarct volume in reperfusion group and sevoflurane group were significantly larger（P＜0.05）；compared with the reperfusion group，the infarct volume in sevoflurane group was decreased significantly（P＜0.05）.②Compared with the control group，the expression ofmRNA and protein of TDAG8 in reperfusion group and sevoflurane group were increased significantly（both P＜0.05）；the expression of mRNA and protein of TDAG8 in sevoflurane group were markedly decreased than the reperfusion group（P＜0.05）.Conclusion：Sevoflurane preconditioning could downregulate the expression of TDAG8 in the penumbra of rat cortex，which might protect against cerebral ischemia from reperfusion insult.

sevoflurane；preconditioning；brain ischemia-reperfusion；T cell death-associated gene 8；middle cerebral artery occlusion

R743.31

A

1671－7783（2014）01－0036－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y120131

束薇薇（1987—），女，碩士研究生；邵東華（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail：shaodonghua1964＠yahoo.com.cn

2012－11－18 ［編輯］劉星星