樊路娟，張春霞，徐慶剛，張馳宇

（1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海200025）

羅氏HIV-1定量檢測引物SK145和SKCC1B的評估及優(yōu)化

樊路娟1，2，張春霞1，徐慶剛1，張馳宇1，2

（1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海200025）

目的：評估羅氏HIV-1檢測系統(tǒng)中引物SK145和SKCC1B對不同亞型HIV-1病毒定量檢測的廣譜性及準(zhǔn)確性，并在此基礎(chǔ)上對該引物進(jìn)行優(yōu)化。方法：下載并分析5個(gè)主要HIV-1流行亞型（B、C、A、01＿AE、D）在引物SK145和SKCC1B擴(kuò)增區(qū)段的對應(yīng)序列，從各亞型篩選出所占比例最高的5條序列構(gòu)建定量標(biāo)準(zhǔn)品。用梯度稀釋的HIV-1各亞型標(biāo)準(zhǔn)品來評估引物SK145和SKCC1B的擴(kuò)增效率。為改善引物SK145和SKCC1B對HIV-1不同亞型擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和廣譜性，我們重新設(shè)計(jì)了一對簡并引物并分析其對不同亞型病毒的擴(kuò)增效果。結(jié)果：引物SK145、SKCC1B對于B亞型病毒的擴(kuò)增效果最好，而對非B亞型病毒的擴(kuò)增效果并不理想，簡并引物能顯著改善對各亞型HIV-1病毒擴(kuò)增的效果。結(jié)論：羅氏引物SK145和SKCC1B不適用于非B亞型HIV-1病毒載量的定量檢測，而優(yōu)化設(shè)計(jì)的簡并引物能改善對各亞型HIV-1病毒的擴(kuò)增效率，因而可用于中國等HIV-1多亞型共流行國家的HIV-1病毒載量檢測。

人類免疫缺陷病毒1型；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；SK145；SKCC1B

人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）是導(dǎo)致全球艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome，AIDS）流行的主要病原體。HIV-1的遺傳異質(zhì)性是影響病毒載量定量可靠性的一個(gè)重要因素，而所有的核酸擴(kuò)增或信號擴(kuò)增技術(shù)都依賴于HIV-1序列特異性的引物和（或）探針，引物（探針）結(jié)合區(qū)的核苷酸不匹配會(huì)干擾雜交從而影響定量結(jié)果的可靠性。

羅氏分子系統(tǒng)（Roche Molecular Systems）的HIV-1病毒載量檢測技術(shù)中，AMPLICOR?HIV-1 MONITOR Test version 1.5和COBAS?AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test version 1.5都獲得美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證，是臨床監(jiān)控正在進(jìn)行抗病毒治療HIV-1患者病毒載量的金標(biāo)準(zhǔn)［1－2］。這兩種檢測方法使用相同的引物SK145、SKCC1B，得到155 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谠u估引物SK145、SKCC1B對高度變異型病毒HIV-1定量檢測的廣譜性及準(zhǔn)確性，并且在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一對廣譜性更高、特異性更強(qiáng)的簡并引物de-F、de-R。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和載體 JM109感受態(tài)細(xì)胞、pGH載體（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.1.2 主要試劑盒及試劑 柱式質(zhì)粒DNAout（北京天恩澤基因科技有限公司）；ScaⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段純化試劑盒（TaKaRa公司）；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）Ⅱ型（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；實(shí)時(shí)PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要儀器 One DropTMOD-1000分光光度計(jì)（南京五義科技有限公司）、Mx3000P／3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國安捷倫公司）。

1.2 方法

1.2.1 序列篩選與合成 根據(jù)HIV數(shù)據(jù)庫（http：／www.hiv.lanl.gov／components／sequence／HIV／geo／geo.comp）中全球HIV-1序列分布情況，選取所占比例最高的5個(gè)亞型：B（58.2%），C（15.1%），A（7.5%），01＿AE（4.7%），D（3.7%）。這5個(gè)亞型的病毒占感染樣本總比例的89.2%，可用來全面準(zhǔn)確地評估引物SK145、SKCC1B對不同亞型HIV-1病毒的擴(kuò)增效率。由于引物SK145（1359→1388）、SKCC1B（1513→1486）的擴(kuò)增產(chǎn)物位于HIV-1基因組1359→1513區(qū)段，因此本實(shí)驗(yàn)從HIV數(shù)據(jù)庫中下載這5個(gè)亞型病毒在HIV基因組1359→1513區(qū)段的所有序列，用MEGA5處理并經(jīng)DAMBE比對后從各亞型分別篩選出占比例最高的5條序列，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。用MEGA5處理上述25條序列并刪除上下游引物間區(qū)域（1389→1485）只保留上下游引物對應(yīng)區(qū)序列，用DAMBE繼續(xù)比對后得到15條獨(dú)特序列。找到這15條序列所對應(yīng)原始序列并在1359→1513區(qū)段前后各延伸5 bp得到長165 bp（1354→1518）的15條序列：A1，A3，A5，B1，B2，B4，C2，C4，D1，D3，D4，01＿AE1，01＿AE2，01＿AE4，01＿AE5。由上海捷瑞生物工程有限公司合成這15條序列并克隆到pGH載體。

1.2.2 簡并引物設(shè)計(jì)和合成 處理并統(tǒng)計(jì)上述各亞型毒株在引物SK145、SKCC1B擴(kuò)增區(qū)段（1359→1513）所占比例最高的5條序列（5個(gè)亞型×5條），分別只保留上游和下游引物對應(yīng)區(qū)序列，比對所得的25條上游（1359→1388）和下游（1513→1486）引物區(qū)對應(yīng)序列，并統(tǒng)計(jì)各一致序列條數(shù)，根據(jù)上下游引物區(qū)序列比對結(jié)果并充分考慮GC含量、3′末端序列等因素后設(shè)計(jì)出上下游簡并引物：de-F（AGTGGGGGGACAYCARGCAGC）、de-R（TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC），并由上海生工公司合成。

1.2.3 制備重組質(zhì)粒 將克隆到pGH載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后用菌液PCR篩選陽性克隆，按照柱式質(zhì)粒DNAout試劑盒的操作說明提取質(zhì)粒。

1.2.4 Sca I酶切質(zhì)粒 pGH載體上有一個(gè)ScaⅠ酶切位點(diǎn)，可使環(huán)狀質(zhì)粒變?yōu)榫€性質(zhì)粒。酶切體系：ScaⅠ2.5μL，10×H緩沖液5μL，質(zhì)粒DNA≤2.5μg，加滅菌水補(bǔ)足50μL總體系，37℃酶切4 h后，取4μL酶切反應(yīng)液電泳觀察其條帶，判斷酶切是否完全。

1.2.5 純化線性質(zhì)粒 將所得線性質(zhì)粒的酶切反應(yīng)液按快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）Ⅱ型操作說明進(jìn)行純化。

1.2.6 制備15個(gè)亞型線性質(zhì)粒儲存液 用超微量紫外分光光度計(jì)測純化后線性質(zhì)粒的純度和濃度，純度要求D（260 nm）／D（280 nm）的值介于1.8～2.0，質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝／mL）＝D（260 nm）× 50μg／mL×10－6×6.02×1023／［650（dolton／bp）×堿基對數(shù)目］，計(jì)算得到質(zhì)粒濃度。用pH 8.0的1× TE將各亞型線性質(zhì)粒濃度調(diào)整到109拷貝／mL，每管100μL分裝多管，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 評估引物SK145、SKCC1B對15個(gè)亞型線性質(zhì)粒的擴(kuò)增效率 用pH 8.0的1×TE對15個(gè)亞型線性質(zhì)粒的儲存液（每次定量時(shí)各取出一管冰上融化）進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋，選取1×108拷貝／mL、1×107拷貝／mL這兩個(gè)梯度的稀釋液為模板，SK145、SKCC1B為上下游引物，B1亞型線性質(zhì)粒109～105copies／mL的稀釋液為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行SYBR Green熒光定量，各亞型各濃度梯度重復(fù)定量3次。冰上配置PCR體系（20μL）：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10.0μL，SK145（10μmol／L）0.8μL，SKCC1B（10 μmol／L）0.8μL，ROX參比染料0.4μL，質(zhì)粒模板2.0μL，滅菌蒸餾水6.0μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃30 s；兩步法擴(kuò)增95℃5 s，60℃34 s，循環(huán)40次；熔解曲線95℃15 s，60℃1 min，每30 s升溫0.5℃，循環(huán)71次后達(dá)95℃，95℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，并給出各亞型線性質(zhì)粒的拷貝數(shù)（即實(shí)驗(yàn)值）。計(jì)算熒光定量實(shí)驗(yàn)值／理論值的百分比，并匯總分析。

1.2.8 評估簡并引物de-F、de-R對15個(gè)亞型線性質(zhì)粒的擴(kuò)增效率 以de-F、de-R為上下游引物，采用SYBR Green熒光定量（方法同1.2.7）對15個(gè)亞型線性質(zhì)粒的擴(kuò)增效率進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1 線性質(zhì)粒的電泳結(jié)果

將各亞型的重組質(zhì)粒單酶切并純化后得線性質(zhì)粒，電泳后得到3 082 bp的條帶（圖1），和預(yù)期產(chǎn)物結(jié)果一致。

圖1 線性質(zhì)粒和環(huán)狀質(zhì)粒

2.2 B1亞型線性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線結(jié)果

將梯度稀釋的B1亞型線性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（109～105拷貝／mL），用熒光定量PCR重復(fù)測定3次，每次每個(gè)稀釋度重復(fù)3管，熒光定量PCR結(jié)束后系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，見圖2。如圖所示各梯度擴(kuò)增曲線間隔分布均勻，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2＝0.997，說明線性質(zhì)粒在此稀釋范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系?；貧w方程：Y＝－3.490× Log（X）＋39.25，擴(kuò)增效率為93.4%，說明反應(yīng)體系及反應(yīng)條件適宜且擴(kuò)增效率較高。熔解曲線結(jié)果為單峰，產(chǎn)物T m值（熔解溫度）一致（均為85℃），說明引物特異性強(qiáng)，無非特異性擴(kuò)增。

圖2 擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線

2.3 簡并引物設(shè)計(jì)

各亞型毒株分別在引物SK145（1359→1388）、SKCC1B（1359→1513）對應(yīng)區(qū)域所占比例最高的5條序列（5個(gè)亞型×5條），匯總結(jié)果如圖3所示。分別比對這25條上游和下游引物對應(yīng)區(qū)序列，并統(tǒng)計(jì)各一致序列條數(shù)，結(jié)果見圖3。

在充分考慮上述5種流行亞型序列特征的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)簡并引物，其序列如下：de-F：AGTGGGGGGACAYCARGCAGC，de-R：TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC。

圖3 引物SK145、SKCC1B對應(yīng)區(qū)序列比對及簡并引物設(shè)計(jì)

2.4 各引物對15個(gè)亞型基因片段定量的可靠性比較

分別以SK145、SKCC1B和簡并引物de-F、de-R為上下游引物，對15個(gè)亞型基因片段的標(biāo)準(zhǔn)品（1×108拷貝／mL、1×107拷貝／mL）進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量，計(jì)算所得實(shí)驗(yàn)值／理論值，各亞型各濃度分別重復(fù)定量3次，將實(shí)驗(yàn)值／理論值的數(shù)據(jù)匯總并計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差（圖5），結(jié)果顯示引物SK145、SKCC1B對于B亞型的擴(kuò)增最為有效，而對其他亞型的擴(kuò)增效果則不太理想（對A、C、D、01＿AE亞型病毒的擴(kuò)增效率分別為25.3%、44.39%、42.43%、35.9%），這可能造成在對非B亞型HIV-1病毒定量時(shí)低估其病毒載量。使用簡并引物de-F、de-R后，除少部分D亞型和01＿AE亞型的線性質(zhì)粒外，其余大部分亞型的線性質(zhì)粒擴(kuò)增效果都有顯著改善（對A、C、D、01＿AE這4個(gè)亞型病毒的擴(kuò)增效率分別提高到31.58%、58.41%、47.82%、43.12%），說明所設(shè)計(jì)的簡并引物對各亞型HIV-1病毒的擴(kuò)增效果比引物SK145、SKCC1B更好，用于病毒載量測定也會(huì)使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

圖5 兩對引物對15個(gè)亞型基因片段擴(kuò)增效果的比較

3 討論

血漿病毒載量對于疾病惡化的預(yù)測以及治療藥物和疫苗潛能的評估至關(guān)重要，并且血漿中HIV RNA的定量已經(jīng)成為HIV-1感染者預(yù)后以及監(jiān)控抗病毒治療效果的主要工具［3－4］，也是治療方案的一大重要組成部分［5］。HIV-1亞型間的遺傳變異以及同一HIV亞型內(nèi)的極端變異顯著影響了臨床樣本中病毒RNA的檢測和定量能力，而HIV-1血漿病毒血癥無論是假陰性還是過低定量甚至是過高定量都可能對患者的治療產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前現(xiàn)有的HIV-1病毒載量檢測技術(shù)能夠?qū)IV-1病毒載量進(jìn)行較好的定量，羅氏分子系統(tǒng)的AMPLICOR?HIV-1 MONITOR Test version 1.5和COBAS?AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test version 1.5更成為定量的金標(biāo)準(zhǔn)。

比較對這兩種診斷方法進(jìn)行評估的國內(nèi)外研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)他們大多采用對一定數(shù)量臨床樣品進(jìn)行定量，然后比較這兩種方法所得定量結(jié)果與其他商業(yè)化檢測方法定量結(jié)果之間的一致性和相關(guān)性的策略。該評估策略不夠系統(tǒng)和全面，其缺陷主要有兩個(gè)方面，首先所用臨床樣品不能涵蓋大多數(shù)流行亞型，且樣品量不夠豐富；其次，雖與其他檢測方法進(jìn)行了比較，但是并沒有與樣品中真正所含病毒載量進(jìn)行比較，因而無法判斷其定量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性。

為解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案并全面搜集數(shù)據(jù)，對AMPLICOR?HIV-1 MONITOR Test version 1.5和COBAS?AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test version 1.5中所使用的引物SK145、SKCC1B進(jìn)行了全面而系統(tǒng)的評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該對引物對B亞型病毒的擴(kuò)增最為有效，而對其他亞型病毒的擴(kuò)增效果并不理想，尤其是對A亞型病毒的定量結(jié)果顯著偏低。為改善引物的擴(kuò)增效果，我們在原引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一對簡并引物de-F、de-R。使用簡并引物后，除少部分D亞型和01＿AE亞型的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品外，其余大部分亞型的擴(kuò)增效果都有顯著改善。

由于羅氏HIV-1檢測系統(tǒng)中的引物SK145和SKCC1B只對B亞型毒株有良好的擴(kuò)增效果，因而適用于北美洲（B亞型流行比例為98.0%）、中美洲（B亞型流行比例為99.6%）等B亞型毒株盛行區(qū)域的HIV-1病毒載量檢測，但是對于中國（B亞型31.3%、07＿BC占28.3%、01＿AE占23.5%）等HIV-1多亞型共流行國家的HIV-1病毒載量檢測則不夠適用。我們優(yōu)化設(shè)計(jì)的簡并引物對各亞型毒株的擴(kuò)增效率都有顯著改善，可用于中國等HIV-1多亞型共流行國家的HIV-1病毒載量的檢測。然而由于HIV-1病毒的高度變異性，我們所設(shè)計(jì)的簡并引物并不能改善所有亞型的擴(kuò)增效率，還需要繼續(xù)尋找更加保守的區(qū)段、采用更為縝密的方法來設(shè)計(jì)更為理想的引物與探針，以進(jìn)一步改善HIV-1定量檢測方法的準(zhǔn)確度和廣譜性。

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Assessment and optim ization of Roche SK 145 and SKCC1B primers for quantification of human immunodeficiency virus type 1

FAN Lu-juan1，2，ZHANG Chun-xia1，XU Qing-gang1，ZHANG Chi-yu1，2

（1.Institute of Life Sciences，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Institute Pasteur of Shanghai，Chinese Academy of Sciences，Shanghai200025，China）

Objective：To assess and optimise applicability and accuracy of primers SK145 and SKCC1B for different HIV-1 subtypes in viral load quantification assay.M ethods：We downloaded and analyzed genomic sequences of fivemain HIV-1 subtypes（B，C，A，01＿AE，D）with the primers SK145 and SKCC1B target.The top five dominant sequenceswere selected from each subtype sequences for the construction of quantification standards.We evaluated amplification efficiency of primers SK145 and SKCC1B for serially diluted standards of each HIV-1 subtype.To improve the amplified spectrum primers SK145 and SKCC1B for different HIV-1subtypes，re-designed this primer pair into degenerate primers according to the top dominant sequences of different HIV-1 subtypes.Results：The amplification efficiency of primers SK145 and SKCC1B was best on quantification HIV-1 subtype B，but not ideal for the non-B subtypes，indicating that primers SK145 and SKCC1B were not able to quantify accurately the viral load of non-B HIV-1 subtypes.When the degenerate primerswere used，we obtained relatively consistent amplification efficiency for various HIV-1 subtypes.Conclusion：Roche SK145 and SKCC1B primerswere unsuitable for viral RNA quantification of HIV-1 non-B subtypes.Compared to Roche SK145 and SKCC1B primers，the optimized degenerate primers can efficiently amplify various HIV-1 subtypes，suggesting that they can be used for HIV-1 viral load assay in China and other countrieswhere various HIV-1 subtypes are co-criculating.

human immunodeficiency virus type 1；real-time PCR；SK145；SKCC1B

樊路娟（1988—），女，碩士研究生；張馳宇（通訊作者），研究員，博士，E-mail：zhangcy1999＠ips.ac.cn

R512.91

A

1671－7783（2014）01－0026－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130207

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81071391）

2013－09－16 ［編輯］何承志