聶顯光 及曉宇 劉羽佳 劉文進(jìn) 王玉成

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱,150040)

檉柳ThERF1與其他ERF家族成員的互作

聶顯光 及曉宇 劉羽佳 劉文進(jìn) 王玉成

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱,150040)

通過(guò)對(duì)檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast分析，得到7個(gè)與ThERF1同源的基因(ThERF4、ThERF7、ThERF11、ThERF12、ThERF13、ThERF14和ThERF16)。利用ClustalX V2.0對(duì)ThERF1和7個(gè)與其同源的基因的AP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，顯示了這8個(gè)ThERF基因保守區(qū)之間的相似關(guān)系。酵母雙雜交結(jié)果表明，ThERF1能與其自身互作，還能與ThERF4、ThERF11、ThERF16互作，說(shuō)明ThERF1能夠與自身或其家族成員形成同源或異源二聚體來(lái)行使功能，進(jìn)而為深入研究ThERF1的耐鹽機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

檉柳(Tamarixhispida);酵母雙雜交;互作蛋白;二聚體

檉柳(Tamarixhispida)廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)的荒漠中，對(duì)干旱、鹽堿、風(fēng)蝕和沙埋等惡劣環(huán)境有抵抗力，尤其對(duì)干旱和高鹽有較強(qiáng)的耐受性，作為一種優(yōu)良的防風(fēng)固沙木本植物，在植物抗逆研究中具有重要的研究?jī)r(jià)值[1-2]。植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境中，必然受到生物脅迫和非生物脅迫的影響，包括病原菌和蟲(chóng)害等生物脅迫，干旱、鹽脅迫、低溫等非生物脅迫，在這些因素的影響下，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理響應(yīng)機(jī)制，以適應(yīng)這種不良環(huán)境因素[3-4]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和應(yīng)對(duì)外部環(huán)境中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要的作用[5]。近年來(lái)對(duì)ERF轉(zhuǎn)錄因子在抗逆中作用的關(guān)注較多。研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子能激活啟動(dòng)子區(qū)域含有GCC-box元件和DRE元件的一系列下游基因的表達(dá)，如Sub1A-1、SNORKEL1,2、RAP2.2、HRE1等，植物在抗逆脅迫中這些基因產(chǎn)物發(fā)揮著不同的功能，提高了植物的抗逆性[6-9]，Zhang等[10]在煙草中轉(zhuǎn)入GmERF3轉(zhuǎn)錄因子，GmERF3基因過(guò)表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱、高鹽脅迫的抗性；從擬南芥中克隆的一種ERF基因HARDY，在三葉草中的過(guò)表達(dá)顯著提高了植物的耐鹽和抗旱能力[11],番茄中的ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子TERF1和JERF1，過(guò)表達(dá)能夠顯著提高植物的抗?jié)B透脅迫和抗旱能力[12-13]。轉(zhuǎn)錄因子需要和自身或其他蛋白通過(guò)其寡聚化位點(diǎn)(oligomerization site)相互作用，這種作用對(duì)其轉(zhuǎn)錄激活以及對(duì)順式作用元件的識(shí)別具有重要作用。因此，研究與轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白對(duì)研究其功能有重要意義。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybrid system)用于在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，是由Stanley Fields和Ok-kyu Song于1989年首次提出并初步建立的[14]，是目前研究蛋白與蛋白相互作用的所有遺傳方法中較為有效和應(yīng)用最廣的工具之一，不僅能夠用于已知蛋白之間的互作，最重要的在于其能與cDNA文庫(kù)結(jié)合使用，可以發(fā)現(xiàn)未知的與誘餌蛋白相互作用的蛋白。

檉柳ThERF1基因在檉柳的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究利用酵母雙雜交的方法，以檉柳ThERF1基因?yàn)檎T餌蛋白，研究其是否與自身及其家族成員互作，篩選與ThERF1相互作用的蛋白質(zhì)，對(duì)探明該基因在鹽脅迫的作用機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

酵母菌株Y2H和Y187，酵母表達(dá)載體pGBKT7、pGADT7、pGADT7-Rec和pGBKT7-p53購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京蓋寧生物公司；限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和EcoR I購(gòu)自Promega公司，ExTaq、DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit和MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System(TaKaRa)，質(zhì)粒(小量)提取試劑盒，膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒(OMEGA)，酵母高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自北京蓋寧生物公司；X-α-Gal和Aureobasidin A(AbA)(TaKaRa)；PEG3350、DMSO、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及卡那霉素和氨芐霉素(Sigma)，氨基酸(BBI)，胰蛋白胨、酵母提取物(Oxoid)和瓊脂糖(Bioweat)均為國(guó)外進(jìn)口試劑，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。溶液配制：RNA提取液為2% CTAB,0.012 5 mol/L硼砂,1.4 mol/L NaCl,pH=8.5,0.1% DEPC 37 ℃過(guò)夜處理。X-α-Gal儲(chǔ)存液：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解X-α-Gal粉末，質(zhì)量濃度為20 mg/mL，-20 ℃避光保存。

1.1 檉柳ThERF1同源基因的序列分析

從檉柳轉(zhuǎn)錄組中獲得7個(gè)全長(zhǎng)的與ThERF1(Genbank:KC171627)同源的基因序列。通過(guò)NCBI的ORF FINDER查找其開(kāi)放讀碼框并翻譯出相應(yīng)的氨基酸序列，用ClustalX V2.0對(duì)ThERF1及其同源基因進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2 載體的構(gòu)建

1.2.1 Bait載體的構(gòu)建

以檉柳cDNA為模板，擴(kuò)增7條與ThERF1同源的基因，將Bait載體(pGBKT7)用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和EcoR I酶切，將同源基因與雙酶切后的pGBKT7同源融合，用熱激法將上述反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，將經(jīng)測(cè)序正確的保存菌種，提取質(zhì)粒為后續(xù)試驗(yàn)使用。

表1 構(gòu)建Bait表達(dá)載體引物

注：表中下劃線(xiàn)為引入的酶切位點(diǎn)。

1.2.2 Prey載體的構(gòu)建

以上述7條與ThERF1同源的基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增加有Prey表達(dá)載體(pGADT7-Rec)粘性末端同源互補(bǔ)序列的基因片段，將其與用SmaI單酶切的pGADT7-Rec載體同源融合，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，將經(jīng)測(cè)序正確的保存菌種，提取質(zhì)粒為后續(xù)試驗(yàn)使用。

表2 構(gòu)建Prey載體引物及pGADT7-Rec載體AD位點(diǎn)兩側(cè)的引物序列

引物名稱(chēng)引物序列(5’-3’)AD-ERF1-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCCCCAGGGATAGTA-AATCGAD-ERF1-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAGGCCAGATCTGACGACGGAGGTAGAD-ERF4-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCACCCGGCATCGGAAD-ERF4-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGCTACGCCACCTCAGCAGAD-ERF7-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGCAAGACGACTTCGTCAD-ERF7-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAATTCCAACAGCAGCAD-ERF11-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGAACCAACAAGCTCAAD-ERF11-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTTAACATGAACTCAATAACAD-ERF12-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGTACAATCCAAGAAGAD-ERF12-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTTAATTACTGCAGTTCAGAD-ERF13-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGGACGTCTCGAGGGAAD-ERF13-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGCTACTCCCAGAAACATGGAD-ERF14-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGATTCGTCATGACCATAD-ERF14-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAATTTTTAATCAAATTCAD-ERF16-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGGACTGCAGGGGGAAD-ERF16-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCACTCCCAAAAACATGM5’ADCTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCM3’ADGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT

注：表中下劃線(xiàn)為引入的酶切位點(diǎn)。

1.3 Bait蛋白的自激活及毒性檢測(cè)

按照酵母雙雜交試劑盒MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System說(shuō)明將pGBKT7質(zhì)粒和pGBKT7-ERF重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H酵母細(xì)胞。將81 μL稀釋10倍、100倍的菌液涂布于直徑為90 mm的SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-Gal/AbA和SD/-Trp/-His的固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.4 Bait與Prey載體共轉(zhuǎn)化酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞

按照Clontech公司酵母雙雜交手冊(cè)進(jìn)行菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞的制備。采用LiAc方法一次進(jìn)行pGBKT7-ThERF1(Bait)+pGADT7-Rec-ThERFs(Prey)和pGBKT7-ThERFs(Bait)+pGADT7-Rec-ThERF1(Prey)以pGBKT7+pGADT7-Rec為陰性對(duì)照。菌液涂布于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿SD/-Leu/-Trp和TDO/X/A(SD/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基中加X(jué)-α-Gal(終質(zhì)量濃度40 mg/L)和AbA(終質(zhì)量濃度70 μg/L))固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.5 陽(yáng)性克隆的二次篩選

挑取TDO/X/A平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好的酵母單克隆和生長(zhǎng)于DDO/X/A篩選培養(yǎng)基上的陰性對(duì)照接種于含有Kan(50 mg/L)的TDO液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁培養(yǎng)，取適量的培養(yǎng)物用dd H2O調(diào)整濃度至OD600值為2，并依次稀釋10、100和1 000倍后，取2 μL未稀釋和稀釋菌液點(diǎn)于含50 mol·L-13-AT的TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d觀(guān)察酵母生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檉柳ThERF1同源基因的序列分析

利用ClustalX V2.0對(duì)ThERF1和7個(gè)與其同源的基因的AP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，顯示了這8個(gè)ThERF基因保守區(qū)之間的相似關(guān)系。并用MEGA 4.0繪制了這些基因之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)。根據(jù)圖1的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以清楚地看出，ThERF1與這7個(gè)ThERF的AP2結(jié)構(gòu)域有較高的保守性，根據(jù)多序列比對(duì)的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，ThERF16(Genbank:KC171642)、ThERF14(Genbank:KC171640)和ThERF13(Genbank:KC171639)有較近的親緣關(guān)系，ThERF1、ThERF4(Genbank:KC171630)和ThERF11(Genbank:KC171637)有較近的親緣關(guān)系，而ThERF7(Genbank:KC171633)和ThERF12(Genbank:KC171638)的親緣關(guān)系較近。

圖1 ThERF1與其他7個(gè)同源ERF基因的保守序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 Bait蛋白自激活及毒性的確定

在SD/-Trp固體平板上培養(yǎng)3 d后Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)兩種酵母菌的長(zhǎng)勢(shì)基本相同，說(shuō)明Bait蛋白(pGBKT7-ERF)對(duì)酵母菌并沒(méi)有毒性，不影響其正常生長(zhǎng)。在SD/-Trp/X平板上培養(yǎng)3 d后，酵母Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)都可正常生長(zhǎng)且菌斑的大小基本相同，但是Y2H(pGBKT7)菌斑呈現(xiàn)白色而Y2H(pGBKT7-ERF)的菌斑則呈現(xiàn)藍(lán)色。在SD/-Trp/-His平板上，Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)均無(wú)法生長(zhǎng)，如圖2。說(shuō)明ThERF1能在一定程度上激活報(bào)告基因MEL1的表達(dá)，但是卻不能激活其他報(bào)告基因的表達(dá)。所以Bait蛋白(pGBKT7-ERF)在酵母體內(nèi)雖然存在部分自激活現(xiàn)象，但是并不妨礙用此雙雜系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

2.3 檉柳ThERF1互作蛋白的驗(yàn)證

為了明確ThERF1與同源ThERF基因的互作關(guān)系，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行篩選，將ThERF1連入pGBKT7載體內(nèi)構(gòu)建Bait載體，命名為BD-ThERF1；將從轉(zhuǎn)錄組中克隆的7個(gè)ThERF(ThERF4、ThERF7、ThERF11、ThERF12、ThERF13、ThERF14、ThERF16)基因作為Prey，構(gòu)建到pGADT7-Rec載體上，構(gòu)建7個(gè)Prey載體，命名為AD-ThERFs。將Bait與7個(gè)Prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的Y2H酵母菌液涂布于TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。然后挑取TDO/X/A平板上的長(zhǎng)勢(shì)良好的藍(lán)色酵母單克隆接種于TDO液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整濃度后分別取2 μL，并依次稀釋10、100和1 000倍后，取2 μL未稀釋和稀釋菌液點(diǎn)于含50 mol·L-13-AT的TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。結(jié)果如圖3-A所示：所有共轉(zhuǎn)化的酵母均能在DDO上生長(zhǎng)，說(shuō)明酵母的生理狀態(tài)及生長(zhǎng)條件正常。但只有Bait(ThERF1)和Prey(ThERF1、ThERF4、ThERF11、ThERF16)共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在TDO/X/A篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并呈現(xiàn)藍(lán)色(如圖3-A)，說(shuō)明二者相互作。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ThERF1與其自身和其他蛋白的互作，我們互換Bait載體與Prey載體。分別以ThERF1、ThERF4、ThERF11、ThERF16作為Bait，構(gòu)建載體BD-ThERF，而將ThERF1作為Prey，構(gòu)建載體AD-ThERF1。同樣，將各Bait與Prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞。與ThERF1為bait的雙雜交結(jié)果一致(圖3-B)，雙雜交后的菌落能夠在TDO/X/A上生長(zhǎng)并呈現(xiàn)藍(lán)色，從而以上bait和prey的互作是真實(shí)的。進(jìn)而表明：ThERF1可與自身形成同源二聚體并與其同家族基因ThERF4、ThERF11和ThERF16形成異源二聚體。

A為Y2H(pGBKT7-ERF)在SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況;B為Y2H(pGBKT7-ERF)在SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。

(A)ThERF1作為Bait與其他ThERF之間的互作 (B)ThERF1作為Prey與其他ThERF之間的互作

圖3 酵母雙雜交分析ThERF1與其他ThERF之間的互作

3 結(jié)論與討論

蛋白與蛋白的相互作用存在于每一個(gè)細(xì)胞的生命過(guò)程中，所有的蛋白質(zhì)要發(fā)揮功能，都會(huì)通過(guò)與其他的蛋白相互作用才能實(shí)現(xiàn)，酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)是分析蛋白相互作用的重要方法之一，為分析體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用了解蛋白質(zhì)功能，還可以尋找新的互作蛋白，具有準(zhǔn)確率較高、不需要抗體和純化蛋白等優(yōu)勢(shì)。自從這項(xiàng)技術(shù)提出以來(lái)，在篩選已知蛋白與互作蛋白的諸多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[15-16]。

1994年，JofukuKD等在分析控制擬南芥花和種子的同源基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了ERF的核心序列[17]，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的AP2和DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族分別行使不同的功能,前者涉及植物的發(fā)育調(diào)控和應(yīng)激信號(hào)通路[18]，后者參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物響應(yīng)非生物的脅迫[19-20]。在生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。除了有小部分蛋白可以單體的形式發(fā)揮其功能外，大部分的蛋白質(zhì)都是通過(guò)和其他蛋白的互作形成復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用的。以基因調(diào)控為例，在基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)接受內(nèi)源或外源信號(hào)，通過(guò)信號(hào)傳遞，激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子基因，最終實(shí)現(xiàn)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性。在這個(gè)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子占有重要的地位，它可以通過(guò)與自身或其他蛋白的互作來(lái)影響其識(shí)別的順式元件種類(lèi)和順式元件的結(jié)合能力[21]。但目前,人們主要研究了ERF轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑以及對(duì)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面,而對(duì)ERF蛋白的互作蛋白的研究甚少。因此,研究ERF轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白,將對(duì)于研究ERF的對(duì)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控具有重要的意義[22]。

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)從檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中找到7個(gè)與ThERF1基因同源的ThERF基因序列，然后進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因有較高的保守性，其中從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出ThERF1與ThERF4和ThERF11的相似性最高(圖1)。而我們的雙雜交研究表明ThERF1與ThERF4和ThERF11相互作用，結(jié)果提示，ThERF1可以與與其同源性高的ERF相互作用，形成異源二聚體(圖3)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ThERF1不僅能與自身蛋白形成同源二聚體，還能與ThERF4、ThERF11、ThERF16蛋白特異性的互作(圖3)，形成異源二聚體行使功能。通過(guò)研究這些蛋白的功能,可以更好地了解ThERF1的調(diào)控機(jī)理,闡明信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)途徑,為抗逆育種提供理論依據(jù)。

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Family Interaction of ERFTamarixhispidaThERF1 with Other Members/

Nie Xianguang, Ji Xiaoyu, Liu Yujia, Liu Wenjin, Wang Yucheng

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(8).-6～9，24

We obtained seven ERF genes by Blast analysis on the transcriptoms fromTamarixhispida, includingThERF4,ThERF7,ThERF11,ThERF12,ThERF13,ThERF14 andThERF16. By mutiple sequence alignments, ThERF1 shared high similarities in the AP2 domain with seven ERFs. By yeast two-hybrid analysis, ThERF1 can interact with itself and also interact with ThERF4, ThERF11 and ThERF16, and it can work in the forms of homodimers with itself or heterodimers with other ERFs.

Tamarixhispida; Yeast two-hybrid; Interacting protein; Dimers

聶顯光，男，1987年10月生，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。

王玉成，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:wangyucheng@ms.xjb.ac.cn。

2013年10月28日。

Q943.2

責(zé)任編輯：潘 華。