張鳳嬌 王玉成 高彩球

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040))

7個檉柳ThMYB基因的鑒定及表達1)

張鳳嬌 王玉成 高彩球

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040))

通過對鹽脅迫不同時間點檉柳根和葉組織的7個轉錄組數據進行分析，鑒定了7條MYB基因(命名為ThMYB1～ThMYB7)，這些基因編碼蛋白氨基酸殘基數為206～918 aa，編碼蛋白的相對分子質量為22.9～75.9，理論等電點為5.06～9.71。進一步分析了7個ThMYB基因在鹽堿脅迫(0.3 mol·L-1NaHCO3)不同時間點檉柳不同組織中的表達譜，結果表明：盡管這7個ThMYB蛋白長度差異較大、同源性較低，但除ThMYB7外的其他7個ThMYB基因的表達均受鹽堿脅迫調控，能對鹽堿脅迫作出應答。

檉柳；鹽脅迫；表達譜；MYB轉錄因子

MYB轉錄因子指含有MYB結構域的一類轉錄因子，是目前植物中最大的一類轉錄因子。 MYB結構域是由52個氨基酸殘基采用螺旋-轉角-螺旋的形式與DNA結合組成，一般都含有3個保守的色氨酸殘基且相鄰的兩個色氨酸間一般相隔18或19個氨基酸，這些色氨酸起著疏水核心的作用[1]。MYB結構域的C端常是由富含酸性氨基酸的轉錄激活區(qū)組成并折疊成具有雙親性的螺旋狀，因而具有一定的可塑性[2]。植物MYB蛋白中首先發(fā)現MYB結構域重復3次且不完全重復的R1R2R3結構，后又發(fā)現MYB結構域二次重復的R2R3結構，單一MYB結構域R1也存在于植物中[3]。玉米C1基因是第一個測序分離得到的MYB基因(C-MYB)[4]，而擬南芥中的MYB基因是第一個被詳細描述并分類的[5]。此外，煙草(NicotianatabacumL.)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、大豆(Glycinemax(L.) Merrill)、蘋果(Malusxdomestica)、甘蔗(Saccharumofficinarum)和番茄(Solanumlycopersicum)等多種植物中都發(fā)現存在MYB轉錄因子[6-11]。

研究表明MYB轉錄因子在植物的生長發(fā)育過程中具有多種不同的生理調節(jié)功能，如調控細胞的生長發(fā)育、應答外界環(huán)境刺激、作為信號傳導植物激素調節(jié)和參與植物次生代謝物的合成調節(jié)等[3]。如番茄中存在與擬南芥部分MYB基因相似的一類R3-MYB，其具有調節(jié)植物根毛發(fā)育功能[11]；大豆中PsMYB1具有調節(jié)下游MAP激酶及影響大豆疫酶形成的功能[8]；菊花CmMYB2基因在抗旱耐鹽以及調節(jié)開花時間方面都起到一定的作用[12]；馬鈴薯中MYB轉錄因子與植物響應干旱脅迫相關，其中過表達StMYB1R-1可以提高馬鈴薯的抗干旱水平[7]；Rahaie[13]等人研究發(fā)現小麥TaMYB基因受鹽和干旱脅迫影響，10個TaMYB轉錄因子在鹽脅迫下均表現為上調表達；擬南芥AtMYB20基因可以通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的表達從而影響ABA信號途徑以達到提高植物耐鹽性的作用[14]。

目前關于MYB轉錄因子對非生物脅迫響應的研究主要集中在草本植物中，而木本植物中MYB轉錄因子調節(jié)抗旱耐鹽功能的研究較少。檉柳是一種抗旱耐鹽能力非常強的木本鹽生植物，克隆檉柳MYB基因，并分析其耐鹽堿能力具有重要意義。本研究中，筆者通過對已建立的鹽堿脅迫不同時間點檉柳根和葉部組織的7個轉錄組文庫序列進行比對分析，從而獲得了7個全長ThMYB基因，通過生物信息學工具對這7個基因進行了序列分析，并進一步通過對文庫基因表達查找獲得了ThMYB基因在不同組織和鹽堿脅迫不同時間的表達模式。為系統(tǒng)研究檉柳ThMYB基因的功能和通過基因工程手段將該基因用于林木抗性育種奠定了理論基礎和提供基因序列材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的處理

剛毛檉柳種子播種于人工土(V(泥炭土)∶V(沙)=2∶1)中，置于相對濕度為65%～75%，光強為400 μmol·m-2·s-1，平均溫度為(22±2)℃溫室中生長。待生長2個月后，用0.3 mol·L-1NaHCO3溶液澆灌根部，進行脅迫處理，分別在處理0(脅迫處理前)、12 、24和48 h后，取其葉和根放入液氮中速凍用于RNA的提取。

1.2ThMYB基因的克隆與序列分析

CTAB法提取各處理時期的RNA，將提取的RNA樣品送至深圳華大基因科技有限公司進行轉錄組文庫的構建和測序[15]。對測序比對拼接后的結果用“MYB transcription factor”作為關鍵詞進行查找，對查找后的序列進一步利用BLASTX軟件進行比對確認，結合ORF founder ( http: / /www. ncbi. nlm. nih.gov/gorf. html)程序確定是否具有完整的開放讀碼框。選擇具有完整ORF的MYB基因，進一步設計引物，以檉柳cDNA為模板，PCR測序后證實獲得了7個ThMYB基因序列。用ProtParam (http://www.expasy.org/tools/ protparam. html) 軟件計算推導的ThMYB蛋白質的相對分子質量及理論等電點。運用Pfam(蛋白家族數據庫，http://pfam.sanger.ac.uk/)對7個ThMYB基因推導的蛋白序列進行驗證是否含有MYB結構域。通過TAIR(http://www.arabidopsis.org/)查找出159個擬南芥MYB基因，利用ClustalX軟件將這159個擬南芥MYB基因與ThMYB基因進行多序列比對，利用MEGA4.1軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

1.3 鹽脅迫檉柳ThMYB基因表達譜分析

通過對實驗室以往測定的7個檉柳轉錄組測序結果的查找，獲得每個ThMYB基因在7個轉錄組中的RPKM(Reads Per kb per Million reads)值，利用RPKM倍數計算分析這7個ThMYB基因在不同測序文中的表達差異倍數，從而獲得基因表達譜[16]，并運用Cluster 3.0軟件，采用Average linkage聚類方法對基因表達數據進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 編碼ThMYB蛋白基因的獲得及序列分析

通過對檉柳7個轉錄組(NaHCO3脅迫0，12，24 h葉轉錄組和NaHCO3脅迫0，12，24，48 h根部轉錄組)基因序列的比對查找，共獲得7個ThMYB單一基因。進一步的序列分析發(fā)現這7個ThMYB基因具有完整的開放讀碼框(ORFs)，因此推測為全長基因，命名為ThMYB1～ThMYB7。這7個ThMYB基因的ORFs編碼蛋白推測的氨基酸殘基數為206～918 aa，預測的相對分子質量為22.9～75.9，理論等電點為5.06～9.71(表1)。Pfam分析結果表明，這7個ThMYB蛋白都至少具有一個典型的MYB結構域。利用ClustalX軟件對這7個ThMYB蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，結果表明，這7個MYB蛋白的同源性為9.09%～50%(表2),每個MYB蛋白都含有MYB家族特有的色氨酸且一般相隔18或19個氨基酸出現一個色氨酸(圖1)。

表1 剛毛檉柳7個ThMYB基因序列特征

表2 7個ThMYBs基因間的序列一致性 %

Chen[17]等通過對擬南芥全基因組序列查找確定了4種主要類型MYB基因：包括R2R3-MYB基因；R1R2R3-MYB基因；4R-MYB基因；MYB-related基因，其中MYB-related基因又分為5個亞家族分別是CCA1-like，CPC-like，TBP-like，I-box-binding-like和R-R-type。通過BlastX比對分析發(fā)現7個檉柳ThMYB基因和擬南芥的MYB-related、R2R3-MYB的同源性較高，因此選擇擬南芥MYB-related和R2R3-MYB兩種類型MYB基因蛋白序列和7個檉柳ThMYB基因蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析(圖2)。結果表明，除了ThMYB4屬于MYB-related類外，其他6個ThMYB均歸為R2R3-MYB類。

2.2 檉柳ThMYB家族基因應答高鹽脅迫的表達模式分析

為了進一步分析ThMYB基因在鹽堿脅迫下的表達特征，對我們前期獲得的檉柳NaHCO3脅迫不同時間點的檉柳轉錄組數據進行了分析，獲得了7個ThMYB基因在NaHCO3脅迫后不同時間點的組織(根和葉)表達譜(表3，表4)，并利用Cluster 3.0對基因表達數據進行聚類分析(圖3)。結果表明，7個ThMYB基因表達具有不同的組織特性，其中ThMYB1-5主要是在根中表達，尤其是ThMYB1，非脅迫處理時，根中的表達量是葉中的9.5倍，NaHCO3脅迫24 h后， 根中的表達量為葉中的330.8倍。而ThMYB6和7在根中的表達量明顯低于葉中的表達量。如ThMYB6在脅迫 24 h根中的表達量僅為葉中的3.1%。

圖1 7個ThMYB基因多序列比對分析(下劃線表示MYB結構域)

基因名稱基因編號log2(根中基因表達量/葉中基因表達量)0h12h24hThMYB1Unigene144903.256.828.37ThMYB2Unigene362641.39-1.054.76ThMYB3Unigene483323.872.631.84ThMYB4Unigene459900.430.624.40ThMYB5Unigene463932.450.811.38ThMYB6Unigene48749-3.54-1.89-4.99ThMYB7Unigene45992-0.72-0.64-1.40

表4 NaHCO3脅迫不同時間點檉柳ThMYB家族基因相對表達水平

基因名稱基因編號葉log2(A)log2(B)根log2(A)log2(B)log2(C)ThMYB1Unigene144901.831.145.396.252.63ThMYB2Unigene362641.30-2.16-1.131.22-0.51ThMYB3Unigene483321.102.14-0.130.11-1.46ThMYB4Unigene459900.81-3.110.990.860.14ThMYB5Unigene463930.85-3.13-0.79-4.20-0.10ThMYB6Unigene48749-1.231.410.41-0.05-0.96ThMYB7Unigene45992-0.020.110.05-0.58-0.06

注：A、B、C為處理12、24、48 h后基因表達量與未處理的比值。

圖3 7個ThMYB基因的聚類分析

對NaHCO3脅迫后7個ThMYB基因的表達模式分析結果表明，除ThMYB7基因的表達在鹽堿脅迫后變化不明顯外，其他的6個ThMYB基因的表達都至少在一個組織的一個時間點表達量發(fā)生明顯變化。其中ThMYB1在檉柳根和葉中均受NaHCO3脅迫強烈誘導，最高被誘導76.1倍。ThMYB5則主要表現為受NaHCO3脅迫抑制，在脅迫24 h根中表達量達最低，僅為對照的5.4%。ThMYB4在葉中表達也明顯受NaHCO3脅迫的抑制，脅迫24 h表達量為對照的11.6%。表明這些基因能對NaHCO3脅迫作出應答，但具有不同的組織特異性。利用Clustal軟件對這7個ThMYB基因的表達趨勢進行聚類分析，結果表明，這7個ThMYB基因的表達模式可大致分為三類：第一類包括ThMYB1、ThMYB2和ThMYB4，第二類包括ThMYB3和ThMYB6，第三類包括ThMYB5和ThMYB7。

3 結果與討論

檉柳生態(tài)適應性很強，能夠抗干旱、耐鹽堿和耐高溫，這些特點使得對檉柳的應激相關基因的克隆和抗逆性機制的研究具有重要意義[18]。盡管這樣，目前只有少數關于檉柳耐鹽、抗干旱的相關基因的研究。MYB家族蛋白是目前植物中研究較為熱點的一類蛋白，MYB轉錄因子參與調控多種植物應激反應，其中MYB轉錄因子在植物抗鹽耐旱方面也存在一定作用[19]。

本研究通過對檉柳鹽堿脅迫不同組織不同時間點的7個轉錄組數據分析從而克隆獲得了7個ThMYB基因，對這7個ThMYB基因的保守序列、系統(tǒng)進化和鹽堿脅迫下的時間和組織表達譜等信息進行分析。7個檉柳ThMYB基因的推導蛋白長度為206～918 aa，雖然變化較大但這7個ThMYB基因都具有保守的MYB結構域。參照Chen[17]等的擬南芥MYB基因分類，檉柳ThMYB基因主要歸為R2R3-MYB亞家族(包括ThMYB1、ThMYB2、ThMYB3、ThMYB5、ThMYB6、ThMYB7)和MYB-related亞家族(ThMYB4)。然而，歸于同一亞家族的ThMYB基因在鹽堿脅迫后的表達趨勢并不一致，如R2R3-MYB亞家族的ThMYB1表達明顯上調，而ThMYB5表達強烈一致。表明不同的ThMYB基因可能受不同的信號調控，參與不同的脅迫通路應答途徑。

已有研究表明土豆中的單一MYB蛋白具有非生物脅迫響應并且可以提高植物的耐鹽性[7]。小麥TaMYB基因具有增強植物耐鹽抗旱能力，在NaCl、PEG和ABA脅迫下TaMYB33可以通過保持滲透壓平衡和清除活性氧(ROS)從而增強小麥的抗鹽抗旱能力[20]。水稻OsMYB基因對干旱、鹽堿環(huán)境具有一定的耐受性，OsMYB2屬于R2R3-MYB其過表達植物的耐鹽抗旱能力力比野生型更敏感，Yang[21]等人研究發(fā)現過表達OsMYB2植物積累了大量可溶性糖、過氧化氫(H2O2)和丙二醛從而使植物具有一定的耐鹽抗旱能力。然而木本植物的MYB基因的功能研究較少，檉柳ThMYB還未開展抗旱耐鹽功能方面的研究，還需要進一步完善。至于ThMYB基因如何調控檉柳耐鹽堿生理功能以及參與檉柳的耐鹽堿應答調控途徑更有待進一步研究。

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Identification and Salinity-alkali Stress Expression Analysis of SevenThMYBGene fromTamarixhispida/

Zhang Fengjiao, Wang Yucheng, Gao Caiqiu

(State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(8).-1～5

Seven full length cDNAs ofThMYB(named as ThMYB1-7) were cloned from seven transcriptome cDNA libraries ofTamarixhispida. TheseThMYBgenes encode proteins of 206-918 amino acid residues with the molecular mass of 22.9-75.9 kDa and theoretical isoelectric point of 5.06-9.71. The gene expression profiles inT.hispidaresponding to NaHCO3were further investigated by analyzing seven transcriptome data. AllThMYB(exceptedThMYB7) expression were regulated by saline-alkali stress, although theseThMYBproteins shared different length and low homology. It suggested that theThMYBs may involved in the saline-alkali stress tolerance ofT.hispida.

Tamarixhispida; Salt stress; Expression profile; MYB transcription factor

1) 黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12523017)和國家自然科學基金資助(31270708)。

張鳳嬌，女，1989年10月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，碩士研究生。

高彩球，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，副教授。E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn。

2013年8月22日。

S718.46

責任編輯：潘 華。