段明慧 盧 習(xí) 張 偉 李玲玲 陳樹林 趙善廷 (西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊陵 712100)

1888年，西班牙神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)家Ramóny Cajal［1］利用Golgi染色方法發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)。隨著電子顯微鏡的出現(xiàn)，科學(xué)家們證實(shí)了神經(jīng)元樹突棘作為突觸連接間的重要部件，是一種突出于神經(jīng)元樹突表面的微小膜性結(jié)構(gòu)。它具有一定的能動(dòng)性，其形態(tài)具有一定的可塑性。在大腦發(fā)育過程中，樹突棘與突觸的發(fā)生密切相關(guān)。突觸的可塑性常常與樹突棘的形成、脫落、擴(kuò)張、萎縮等形態(tài)變化相伴發(fā)生。樹突棘形態(tài)的改變與突觸效應(yīng)的強(qiáng)弱及長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(Long-term potentiation，LTP)也有密切關(guān)系［2-4］。LTP誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹突棘的數(shù)量和形態(tài)的改變對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶有著重要的研究意義，特別是在海馬和大腦皮層。

神經(jīng)元樹突棘作為突觸后膜的主要存在部位，是神經(jīng)元接受外界信息、表現(xiàn)環(huán)境適應(yīng)性、實(shí)現(xiàn)自身功能的主要部位。樹突棘結(jié)構(gòu)的異常與神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙也息息相關(guān)。在病理學(xué)研究中顯示阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)、帕金森綜合癥(Parkinson’s disease)、脆性X染色體綜合征(Fragile-X syndrome)、癲癇(Epilepsy)、精神分裂癥(Schizophrenia)、成癮(Addiction)、中風(fēng)(Stroke)等疾病中都有樹突棘的結(jié)構(gòu)畸形［5，6］?？梢?，樹突棘的形態(tài)和動(dòng)力學(xué)特征對(duì)神經(jīng)障礙疾病的臨床診斷和治療都具有重大意義。

在哺乳動(dòng)物中，位于大腦縱裂底部的胼胝體是腦內(nèi)最大的連合系統(tǒng)，由兩側(cè)大腦皮層錐體細(xì)胞發(fā)出的軸突集合而成，負(fù)責(zé)兩側(cè)大腦半球之間的信息交換。近年來，遺傳學(xué)研究顯示分子信號(hào)通路對(duì)其投射的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維導(dǎo)向尤為重要。這不僅在神經(jīng)科學(xué)研究上更在臨床上有重大意義。胼胝體的發(fā)育畸形與人類許多先天性疾病相關(guān)，例如發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)障礙、智力障礙、癲癇、視力降低、語言障礙、情感和行為異常等［7，8］。

子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)(In utero electroporation，IUE)是研究基因功能的缺失和超表達(dá)的新型方法體系。相對(duì)于其他轉(zhuǎn)基因方法，IUE更為快速簡便，高效并具選擇性。雖然一個(gè)世紀(jì)以前科學(xué)家利用多種方法對(duì)神經(jīng)元發(fā)育包括樹突棘形成及神經(jīng)纖維歸巢的研究就已經(jīng)開始，但關(guān)于其具體的分子機(jī)制、信號(hào)通路等仍舊不甚清楚。為更好的研究神經(jīng)元發(fā)育，并由此指導(dǎo)其功能性的研究，利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)將帶pCAG啟動(dòng)子表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鼠胚大腦皮質(zhì)的新生神經(jīng)元中，在小鼠出生當(dāng)天(Postnatal day 0，P0)和P28取材固定，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察被轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括樹突、軸突及樹突棘，研究樹突棘的形態(tài)學(xué)特征和神經(jīng)纖維歸巢的情況，從而為進(jìn)一步研究神經(jīng)元發(fā)育奠定了一種新型的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)中用到的動(dòng)物為孕期(Embryonic day，E)為 15.5 d 的 C57BL/6J小鼠共 10只。成年C57BL/6J小鼠(3月齡)購自西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。C57BL/6J小鼠放置于超凈鼠房［室溫(26±1)℃，相對(duì)濕度50% ～60%］適應(yīng)7 d。按照雌∶雄=2∶1的比例進(jìn)行合籠，次日上午檢查陰道栓。若見陰栓，當(dāng)天上午記為孕期E0.5，小鼠出生當(dāng)天記為P0。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)采用的電轉(zhuǎn)質(zhì)粒由雞的βactin啟動(dòng)子啟動(dòng)EGFP，骨架載體pCAG-MCS購自百恩維生物，pEGFP-N1由本實(shí)驗(yàn)室保存。以pEGFP-N1載體為模板通過PCR擴(kuò)增得到EGFP基因片段，PCR引物為EGFP-F(5'-AGATCTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3')和EGFP-R(5'-AGATCTT TACTTGTACAGCTCGTC-3')。將 PCR產(chǎn)物電泳純化后回收，連接到pGEM-T Easy(Promega)上進(jìn)行測序，將測序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用BglⅡ進(jìn)行單酶切，同時(shí)對(duì)pCAG-MCS空載體也用BglⅡ單酶切并用CIAP(TaKaRa)去磷酸化處理。電泳并回收處理后的EGFP基因片段和酶切后的pCAGMCS載體骨架片段，用T4連接酶將EGFP連接于pCAG-MCS的BglⅡ位點(diǎn)。挑取陽性克隆并做PCR鑒定，將陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，保存測序正確克隆即為pCAG-GFP。

1.3 子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染 電轉(zhuǎn)操作過程(圖1)參照Saito等［9］的研究。選取 E15.5孕鼠，稱取其體重。用2～3 ml乙醚基礎(chǔ)麻醉，再行腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)做全身麻醉。待小鼠麻醉完全，剃除腹部被毛，充分暴露術(shù)部消毒皮膚即可開始手術(shù)。

將麻醉完全的小鼠背臥式放于37.5℃恒溫板上。將一次性無菌手術(shù)墊單鋪于術(shù)部，沿腹中線作一長約1.5 cm的縱向切口，打開腹壁。沿腹腔背側(cè)進(jìn)玻璃分針沿胚胎間隔處將左右兩側(cè)子宮輕輕拉出體外，并記錄胚胎情況。

微電極拉制儀(P-97，Sutter，美國)按照如下參數(shù)拉制玻璃微電極:壓強(qiáng)500;熱度800;拉力30;速率40;時(shí)間1;平頭鑷子將玻璃微電極于外徑為50～80μm處作平齊斷口。利用拉制好的玻璃微電極吸取1～1.5μl的pCAG-GFP質(zhì)粒(質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室存留，濃度1～5μg/μl)將質(zhì)粒載體準(zhǔn)確注射入小鼠胚胎大腦一側(cè)的側(cè)腦室中。將板狀電極置于注射質(zhì)粒的小鼠胚胎頭部兩側(cè)，正極放于注射質(zhì)粒一側(cè)，電穿孔儀(ECM830，BTX，美國)給予一定的電刺激。電擊的參數(shù)設(shè)置如下:電壓:30 V;每次持續(xù)時(shí)間:50 ms;間隔時(shí)間:950 ms;電擊次數(shù):5次。

手術(shù)過程中，37.5℃預(yù)熱的0.9% 無菌生理鹽水滴加于子宮外壁，保持濕潤，防止早期流產(chǎn)。電擊轉(zhuǎn)染結(jié)束后將子宮重新放回母鼠體內(nèi)，并加入2 ml含有氨芐青霉素的生理鹽水。利用連續(xù)鎖邊縫合法分別縫合腹壁和皮膚后將孕鼠放回保溫鼠籠，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4 取材及切片 待電擊轉(zhuǎn)染基因小鼠出生后P0，立即在體視熒光顯微鏡(SZX16，Olympus，日本)下觀察，出現(xiàn)綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP顏色)標(biāo)為陽性。部分陽性小鼠立即斷頭處死取腦，用4%多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)固定。其余陽性小鼠繼續(xù)哺養(yǎng)4周后即P28，用4%PFA心臟灌注固定15 min，取出大腦。將大腦組織在4%PFA中后固定過夜。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PB)清洗3次后用瓊脂包埋。在全自動(dòng)震蕩切片機(jī)(VT1000S，Leica，德國)上做連續(xù)冠狀切片，厚度為50μm。

1.5 熒光免疫組織化學(xué) 選取腦片放在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行漂染。首先將切片在Rabbit anti-GFP一抗(1∶500)、Mouse anti-NeuN 一抗(1∶500，Millipore)混合液中4℃孵育過夜，然后0.1 mol/L PB清洗5次，每次10 min。清洗完畢加入Goat anti-rabbit 488二抗(1∶300)、Goat anti-mouse 568 二抗(1∶300，Millipore)混合液，室溫孵育3 h，0.1 mol/L PB清洗5次，每次30 min。DAPI(1∶1 000，Invitrogen)、PI(1∶1 000，Millipore)復(fù)染細(xì)胞核30 min，0.1 mol/L PB清洗5次，每次10 min。最后用熒光封片劑(Fluorescent mounting medium，DAKO，美國)加蓋玻片封片。

1.6 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用激光共聚焦顯微鏡(TCSSP5，LEICA，德國)對(duì)染色后的切片觀察拍照。利用該顯微鏡拼圖和Z軸連續(xù)掃描功能拍攝鼠腦的全景照和單根神經(jīng)元樹突的Z軸層掃疊加照片，用相應(yīng)軟件導(dǎo)出Tiff格式圖片。用Photoshop CS3和Illustrator軟件處理圖片，分析轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元樹突棘的分布和軸突的投射情況。用Image J軟件計(jì)數(shù)大腦皮質(zhì)第Ⅰ層中GFP陽性頂樹突上樹突棘的數(shù)量和密度，并統(tǒng)計(jì)樹突棘的分類情況。僅計(jì)數(shù)頭部清晰可辨的樹突棘，絲狀偽足不作計(jì)數(shù)。每只小鼠選取2張切片進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 帶pCAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒能在體內(nèi)高效長時(shí)程表達(dá)所攜帶基因 本實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)染載體為含雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(pCAG)的質(zhì)粒，在該啟動(dòng)子之后插入表達(dá)EGFP的cDNA序列以標(biāo)記被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中出生后隨即處死的小鼠被轉(zhuǎn)染一側(cè)大腦皮質(zhì)中有很強(qiáng)的綠色熒光(圖2A中的小島)，免疫組化染色切片低倍鏡下觀察，被轉(zhuǎn)染一側(cè)大腦皮質(zhì)中有大量被GFP標(biāo)記的細(xì)胞，絕大多數(shù)位于靠近邊緣帶(Marginal zone，MZ)的部位(圖 2A、B)，表明這些細(xì)胞已經(jīng)完成了遷移過程，到達(dá)了它們的最終目的地。進(jìn)一步放大顯示這些細(xì)胞已初具神經(jīng)元的形態(tài)，頂部有較長的樹突并出現(xiàn)少量分支，底部有細(xì)而長的軸突(圖2C1)。另外，在皮質(zhì)板中還有少量GFP陽性細(xì)胞，它們呈現(xiàn)遷移神經(jīng)元的典型雙極形態(tài)特征，一個(gè)卵圓形胞體，向上發(fā)出一根粗長而光滑的頂突起，向下發(fā)出一根細(xì)而短的尾突起(圖2A、B、C2)，表明它們是正在遷移的神經(jīng)元。為了檢測pCAG-GFP質(zhì)粒能否在神經(jīng)元內(nèi)長時(shí)程表達(dá)，我們對(duì)E15.5轉(zhuǎn)染，P28取材的鼠腦進(jìn)行了觀察。低倍鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染陽性的小鼠，P28的大腦皮質(zhì)內(nèi)仍有大量的GFP陽性細(xì)胞(圖2D)。這表明帶pCAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒在體內(nèi)可高效長時(shí)程表達(dá)。

圖1 鼠胚子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)Fig.1 Schematic representation of IUE protocols

圖2 帶p CAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒能夠在大腦神經(jīng)元中高效長時(shí)程表達(dá)Fig.2 Long-term expression of GFP construct with pCAG promoter in electroporated brains

2.2 GFP陽性細(xì)胞多為晚期出生的神經(jīng)元 P28取材的鼠腦在低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GFP陽性細(xì)胞的胞體多靠近大腦皮質(zhì)的表面，位于皮質(zhì)的淺層，相當(dāng)于大腦皮質(zhì)的Ⅱ～Ⅳ層(圖3A)。高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)GFP陽性細(xì)胞具有大量突起，呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)。胞體呈大的圓形或三角形，從胞體發(fā)出一個(gè)粗而長的頂樹突和多個(gè)較細(xì)且長短不一的基樹突。頂樹突一般伸向大腦皮質(zhì)的表面，并發(fā)出許多分支(圖3B、E，圖4A)。在多數(shù)情況下，在頂樹突的對(duì)側(cè)從胞體上發(fā)出一根細(xì)而長的軸突。

圖3 GFP陽性細(xì)胞為晚期出生神經(jīng)元Fig.3 GFP-positive cells are later-born neurons

為了驗(yàn)證GFP陽性細(xì)胞是否是神經(jīng)元，我們用一種神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物抗體NeuN進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)90%GFP陽性細(xì)胞的胞核為NeuN陽性(圖3B～D)，表明 E15.5轉(zhuǎn)染，P28表達(dá)GFP的細(xì)胞絕大多數(shù)為神經(jīng)元。因?yàn)檫@些GFP陽性神經(jīng)元胞體大多靠近大腦皮質(zhì)的表面，位于皮質(zhì)的淺層，相當(dāng)于大腦皮質(zhì)Ⅱ-Ⅳ層的部位。表明它們應(yīng)為晚期出生的神經(jīng)元，這與轉(zhuǎn)染的時(shí)間點(diǎn)一致。

圖4 GFP陽性神經(jīng)元具有大量樹突棘F(xiàn)ig.4 GFP-labeled neuron with dendritic spines

2.3 GFP陽性神經(jīng)元具有大量的樹突棘 因?yàn)镻28大多數(shù)神經(jīng)元已經(jīng)成熟，應(yīng)具有大量的樹突棘。為了觀察子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染方法是否能夠標(biāo)記樹突棘，我們用油鏡對(duì)切片進(jìn)一步放大觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GFP陽性神經(jīng)元的各級(jí)樹突上有大量形態(tài)不一的小棘狀結(jié)構(gòu)(圖4A～C)。我們對(duì)大腦皮質(zhì)第Ⅰ層中樹突上的小棘進(jìn)行了定量計(jì)數(shù)和分析，小棘的密度約為(11.83±2.17)個(gè)/10μm 樹突。既有矮粗的穩(wěn)定性樹突棘，也有頭小頸細(xì)長的細(xì)長型樹突棘，還有頭大頸粗短的蘑菇型樹突棘，其中細(xì)長型占多數(shù)，為59%，短粗的穩(wěn)定型占23%，而蘑菇型最少，僅占18%。

圖5 GFP陽性神經(jīng)元軸突投射到對(duì)側(cè)的海馬和大腦皮質(zhì)Fig.5 GFP-Labeled axons were traced in the contralateral cortex and hippocampus

2.4 GFP陽性神經(jīng)元的軸突能遠(yuǎn)距離投射 在對(duì)P28取材的鼠腦的冠狀切片進(jìn)行全面觀察后我們發(fā)現(xiàn)，除了在轉(zhuǎn)染一側(cè)的大腦皮質(zhì)有大量GFP陽性的神經(jīng)元胞體及其密集的突起(包括樹突和軸突)外，在對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的某些部位及兩側(cè)海馬及胼胝體中，也有大量 GFP陽性的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)(圖2D，圖5A、B、C)，應(yīng)為被轉(zhuǎn)染一側(cè) GFP陽性神經(jīng)元的軸突。這表明pCAG-GFP質(zhì)粒表達(dá)的GFP不但能夠標(biāo)記被轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的胞體和樹突，而且還可以通過軸突順向運(yùn)輸?shù)竭_(dá)軸突的末端。進(jìn)一步放大觀察表明在兩側(cè)海馬內(nèi)GFP陽性神經(jīng)纖維主要分布于CA1區(qū)的腔隙分子層，在轉(zhuǎn)染對(duì)側(cè)的大腦皮質(zhì)中GFP陽性神經(jīng)纖維主要密集分布于兩個(gè)柱狀區(qū)域，且在皮質(zhì)的淺層(Ⅱ～Ⅲ層)(圖5C)。

3 討論

在神經(jīng)元樹突棘和突觸的可塑性探索中，使樹突棘可視化的技術(shù)方法顯得尤為重要。其中Golgi染色技術(shù)曾在神經(jīng)解剖學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。雖然這種方法較好地保持了神經(jīng)元的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但是Golgi染色法步驟繁瑣，過程較長，并且不能用于做活體觀察，這大大限制了神經(jīng)科學(xué)工作者的研究思路。近年來Ziv和Smith等利用DiO等親脂性熒光染料標(biāo)記神經(jīng)元和樹突棘獲得成功［10-12］。雖然這種方法可以進(jìn)行活體觀察，但是同Golgi染色法一樣，只能非特異性標(biāo)記神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。除此以外，也有學(xué)者利用Thy-1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠觀察神經(jīng)元樹突棘［13］。雖然 Thy-1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠能夠持續(xù)表達(dá)綠色熒光，但是只能用于觀察成熟神經(jīng)元的樹突棘，因?yàn)樵谶@種轉(zhuǎn)基因小鼠中GFP僅在成熟神經(jīng)元中表達(dá)。

神經(jīng)纖維的投射與大腦皮層的分層有重要意義，神經(jīng)元產(chǎn)生的時(shí)間對(duì)軸突的投向也具有一定作用。在哺乳動(dòng)物中，胼胝體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最大的連接纖維束，連接兩側(cè)大腦半球，主要起協(xié)調(diào)雙側(cè)大腦半球的功能。組成胼胝體的神經(jīng)纖維向兩側(cè)大腦半球內(nèi)部的前、后、左、右輻射，連系額、頂、枕、顳葉，形成兩側(cè)側(cè)腦室頂。大腦皮層的胼胝體連接對(duì)兩側(cè)大腦半球的信息交流有著重要作用，但至今其機(jī)理尚未明了，仍有待研究。

本研究中，我們利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)清晰顯示了神經(jīng)元樹突和樹突棘的形態(tài)特點(diǎn)，并且成功觀察到神經(jīng)元軸突和軸突投射的情況，從而允許我們對(duì)大腦發(fā)育過程中神經(jīng)元纖維歸巢進(jìn)行研究。

近年來，研究者借助子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)成功將外源基因轉(zhuǎn)入小鼠和大鼠胚胎［9，14，15］，用以研究大腦皮層的發(fā)育情況，從而展露出該方法在研究大腦發(fā)育和相關(guān)分子機(jī)制方面的優(yōu)勢。相對(duì)于神經(jīng)元樹突棘的其他研究方法，子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)有著更多的優(yōu)勢:①與培育基因敲除鼠相比，該方法操作簡便，可以更為快速地研究目的基因的缺失和超表達(dá)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響;②多種不同的基因能夠同時(shí)轉(zhuǎn)入同一個(gè)細(xì)胞，從而能夠結(jié)合分析基因的功能;③相對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒載體等，該轉(zhuǎn)染方法細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)染效率高。但是，子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)仍然存在一些技術(shù)難點(diǎn)。不同時(shí)期的胚胎所需要電擊參數(shù)不盡相同;胚胎存活率也有待進(jìn)一步提高;實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)對(duì)胚胎的轉(zhuǎn)染效果也有一定影響。

總而言之，子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究大腦不同發(fā)育階段中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域結(jié)構(gòu)功能的一種強(qiáng)而有力的方法。我們利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)，將綠色熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)入小鼠大腦皮層，結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，清晰地顯示了正常發(fā)育過程中被轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括樹突、軸突及樹突棘，使用子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)方法標(biāo)記大腦皮層的錐體細(xì)胞，持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的GFP將這些神經(jīng)元發(fā)出的軸突顯示出來，可以觀察胼胝體的整個(gè)發(fā)育過程。從而為更深入地研究神經(jīng)元發(fā)育，包括樹突棘的發(fā)生和可塑性，神經(jīng)纖維的歸巢的分子機(jī)制等奠定了有力的技術(shù)基礎(chǔ)。

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