王 波，李凱榮，崔碧霄，韓 剛

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌712100）

陜北已經(jīng)成為我國(guó)重要的石油開采基地之一，然而石油開采、冶煉和運(yùn)輸過程中的污染和泄露問題已經(jīng)對(duì)當(dāng)?shù)卮嗳醯纳鷳B(tài)環(huán)境造成巨大威脅。石油污染可引起土壤孔隙堵塞，改變土壤有機(jī)質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)和微生物區(qū)系，并對(duì)植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)力產(chǎn)生影響。與此同時(shí)，石油中的有害物質(zhì)可在植物體內(nèi)積累，并通過食物鏈對(duì)動(dòng)物和人類產(chǎn)生危害。鑒于石油污染的上述威脅，對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù)已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的環(huán)境問題。相對(duì)于其他土壤修復(fù)方法，植物修復(fù)由于具有成本低、無二次污染、吸收污染物量大、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為去除土壤石油污染的首選手段[1]。然而，目前大多數(shù)針對(duì)石油污染土壤修復(fù)植物的研究?jī)H限于考慮草本植物和農(nóng)作物的生長(zhǎng)指標(biāo)或根際降解能力對(duì)土壤石油烴的去除作用，如時(shí)騰飛等[2]研究了石油污染對(duì)豆科牧草發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的潛在影響，并據(jù)此篩選出毛苕子（Viciavillosa）等適于在石油污染區(qū)播種且生長(zhǎng)良好的灌草種，陳嫣等[3]則研究了紫花苜蓿（Medicagosativa）、披堿草（Elymusdahuricus）根際微生態(tài)效應(yīng)對(duì)石油污染的去除效果。此外，尚有關(guān)于大麥（Hordeumvulgare）[4]和三葉草（Trifoliumrepens）等草本植物根系降解石油能力的眾多研究。而由于在陜北地區(qū)特別是一些老油井區(qū)普遍存在先墊土覆蓋后進(jìn)行植被恢復(fù)的現(xiàn)象，草本植物和農(nóng)作物受到根系長(zhǎng)度限制，對(duì)地下石油污染的修復(fù)效果十分有限。在此情況下，篩選適宜在石油污染地區(qū)生長(zhǎng)并等具有修復(fù)石油污染潛能的木本樹種是非常必要的。目前，僅有Spriggs等[5]研究了白楊（Populustomentosa）等樹種對(duì)根際土壤石油污染去除的作用，關(guān)于陜北石油污染區(qū)適生喬木樹種則少見報(bào)道，關(guān)于樹種在石油污染下的生理特征特別是抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的響應(yīng)研究尤為不足。

刺槐（Robiniapseudoacacia）是陜北地區(qū)植被恢復(fù)和重建的主要樹種之一，耐干旱瘠薄，在該地區(qū)表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性。而因其具有根系發(fā)達(dá)、生物量大的特點(diǎn)，能夠穿透覆土層對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù)，具有更強(qiáng)的吸收、降解土壤石油的潛力。對(duì)石油污染刺槐抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的響應(yīng)進(jìn)行研究能更為深刻地反映其對(duì)石油污染的耐受能力，且較之生長(zhǎng)指標(biāo)更為靈敏[6]。據(jù)此，本研究采用盆栽試驗(yàn)對(duì)不同濃度石油污染下，較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)刺槐苗木的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)對(duì)土壤石油污染的響應(yīng)特征進(jìn)行研究，以期闡明石油污染下刺槐苗木抗氧化保護(hù)調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制，確定其對(duì)石油污染的耐受能力，為篩選適宜陜北地區(qū)的木本石油污染修復(fù)植物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

盆栽試驗(yàn)設(shè)在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)苗圃，當(dāng)?shù)貙倥瘻貛О霛駶?rùn)大陸性季風(fēng)氣候，海拔454.5m，年均日照數(shù)2 150h，年均降水635mm，年平均濕度70%左右。年平均氣溫12.9℃，≥10℃年有效積溫4 169.2℃，無霜期221d。

1.2 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)苗木（長(zhǎng)勢(shì)基本一致的1年生刺槐苗）及供試原油購(gòu)自安塞縣。栽培基質(zhì)采集自陜北安塞縣人為活動(dòng)稀少的荒草地表層（0—20cm）無污染土壤，其有機(jī)質(zhì)含量8.45g／kg，全氮0.42g／kg、速效磷5.5 mg／kg、速效鉀74.6mg／kg，pH 值為7.8。

于2011年2月中旬將供試土壤風(fēng)干后過4mm篩，在部分土壤中分別按照石油污染物濃度為5，10，15，20g／kg共4個(gè)水平添加原油（據(jù)在安塞調(diào)查，采油區(qū)內(nèi)原油污染物含量呈不均勻分布狀態(tài)，大致在5～20g／kg的范圍內(nèi)，故盆栽試驗(yàn)設(shè)置上述4個(gè)石油污染濃度水平），多次攪拌混合均勻（不添加任何有機(jī)溶劑），經(jīng)自然平衡60d后過4mm篩備用，以無污染土壤作為對(duì)照栽培基質(zhì)。

于2011年4月中旬在盆栽桶中裝入處理后的栽培基質(zhì)，每桶基質(zhì)相當(dāng)于12.94kg無污染土壤（干重），每處理9桶。將刺槐苗木植入桶中，每桶植3株，定植后放置于可移動(dòng)式防雨棚內(nèi)，防止天然降雨，晴天正常照光，各處理充分供水，以保證成活和正常生長(zhǎng)。至6月底采用稱重法將土壤水分統(tǒng)一控制在各處理土壤的田間持水量75%的水平。為消除苗木對(duì)稱重控水的影響，各處理均毀苗1桶測(cè)苗木鮮重，確定稱重標(biāo)準(zhǔn)。此后為隔30d均毀苗1桶測(cè)苗木鮮重，用于調(diào)校稱重標(biāo)準(zhǔn)。并分別于30，60，90d的上午9：00前后在每處理剩余栽植桶內(nèi)隨機(jī)挑選5桶，并分別在內(nèi)采集5份苗木中部功能葉片測(cè)定抗氧化酶活性以及抗氧化劑、H2O2和MDA含量。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

葉片中抗氧化保護(hù)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)采用下述方法測(cè)定[7]：SOD活性采用氮藍(lán)四唑光還原法，以抑制NBT光反應(yīng)50%為一個(gè)酶活單位；CAT活性采用H2O2分解量法，以每分鐘OD值減少0.1為一個(gè)酶活單位；APX活性采用AsA氧化比色法，以每1min消耗1μmol的AsA為一個(gè)酶活單位；GR活性采用NADPH氧化比色法，以1min內(nèi)OD340下降變化1.0為一個(gè)酶活單位；AsA含量采用H2O2消耗比色法；GSH含量采用DTNB法；Car含量采用丙酮浸提比色法測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；H2O2含量采用過氧化物－Ti復(fù)合物沉淀法測(cè)定。各指標(biāo)均重復(fù)5次測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（one－way ANOVA），多重比較采用最小顯著差法（LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油污染對(duì)刺槐苗木抗氧化酶活性的影響

SOD可以將超氧陰離子自由基歧化成H2O2，在保護(hù)系統(tǒng)中處于核心地位[8]，其活性的高低是植物抗逆性的重要標(biāo)志之一。隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，刺槐苗木葉片SOD活性對(duì)不同濃度石油處理的響應(yīng)有所變化（圖1A）：總體而言，各濃度石油污染處理30d時(shí)，刺槐苗木SOD活性均較對(duì)照顯著降低，其中石油濃度為10，15g／kg 時(shí) 降 幅 最 為 顯 著，達(dá) 51.03% ～54.28%，石油濃度為5，20g／kg時(shí)SOD活性降幅則相對(duì)較小。這可能是由于低濃度下，石油對(duì)SOD的毒性作用相對(duì)較弱，而在高濃度下則對(duì)刺槐幼苗產(chǎn)生強(qiáng)烈脅迫，刺激了SOD活性使其有所提高；隨時(shí)間延長(zhǎng)，各石油濃度下SOD活性較對(duì)照基本無顯著差異或顯著提高，表明長(zhǎng)期污染下刺槐苗木可對(duì)石油污染產(chǎn)生一定適應(yīng)，從而保持正常的活性水平。

圖1 石油污染對(duì)刺槐苗木抗氧化酶的影響

CAT是專性清除 H2O2的保護(hù)酶[9]，其活性隨污染時(shí)間和石油污染濃度的變化規(guī)律與SOD有所不同（圖1B）：在不同濃度石油污染處理30d時(shí)，CAT活性均較對(duì)照顯著降低，其中10，15g／kg石油濃度時(shí)降幅最為顯著（55.08%～76.06%），這與上述SOD活性的變化規(guī)律一致，出現(xiàn)此現(xiàn)象的機(jī)理可能也與SOD活性變化的機(jī)理相似。而60d時(shí)，除5 g／kg石油濃度下CAT活性較對(duì)照增加不明顯外，其他濃度下CAT活性則均較對(duì)照顯著升高，且隨濃度增加呈遞增趨勢(shì)。至處理90d，石油濃度為5，10g／kg時(shí)，CAT活性再次顯著低于對(duì)照（降幅達(dá)31.97%～33.96%），而石油濃度為15，20g／kg時(shí)CAT 活性與對(duì)照無顯著差異。這表明在石油污染短期內(nèi)，CAT活性即受到抑制，而隨時(shí)間延長(zhǎng)，植物對(duì)脅迫環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)，CAT活性逐步恢復(fù)并產(chǎn)生一定提高，且在較高石油濃度下，這種抗脅迫響應(yīng)持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。

APX與SOD和CAT共同構(gòu)成植物的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，三者間具有協(xié)同作用[10]，但在石油污染下APX的響應(yīng)規(guī)律與后兩者存在不同（圖1C）：石油污染處理30d時(shí)，刺槐苗木APX活性較對(duì)照均無顯著差異，而在60，90d時(shí)較對(duì)照顯著降低，且隨石油濃度增加，APX活性降幅趨于明顯，其中石油濃度為15～20g／kg時(shí)降幅可達(dá)57.12%～62.62%，但兩者在同期差異不顯著。表明相對(duì)于SOD和CAT，APX對(duì)短期石油污染的耐受性較高，但對(duì)長(zhǎng)期污染的適應(yīng)性較差。GR是Halliwell－Asada途徑的重要組成部分，對(duì)于葉綠體內(nèi)H2O2的去除具有重要意義。石油污染處理下，刺槐苗木GR活性基本低于對(duì)照同期水平，與APX的變化趨勢(shì)相似（圖1D）：5g／kg濃度石油處理30d和60d時(shí)，GR活性較對(duì)照無顯著差異，至90d時(shí)其活性則顯著降低（降幅為37.78%），表明在污染短期至中期內(nèi)，GR對(duì)較低石油污染具有一定抗性。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，GR受到一定程度的破壞，在10～20g／kg石油濃度下，處理30～90d時(shí)GR活性均出現(xiàn)顯著降低，其中20g／kg下處理90d時(shí)降幅最顯著，表明長(zhǎng)時(shí)間的高濃度石油污染可對(duì)GR的活性產(chǎn)生強(qiáng)烈損害。

2.2 石油污染處理下刺槐苗木抗氧化物質(zhì)含量的變化

AsA是APX最重要的電子供體，缺少AsA時(shí)APX將迅速失活[11]，刺槐苗木AsA受到不同程度石油污染時(shí)其響應(yīng)方式有所差異（圖2A）：各濃度石油污染處理30～60d時(shí)，AsA含量較對(duì)照均無顯著差異或顯著增加的現(xiàn)象（增幅達(dá)4.19%～52.59%），隨后這種趨勢(shì)減弱至不顯著的程度。至處理90d時(shí)，AsA含量在較低石油濃度下則表現(xiàn)為較對(duì)照顯著降低。表明在石油污染短時(shí)段內(nèi)，刺槐苗木通過增加AsA以清除活性氧，但長(zhǎng)時(shí)間污染下AsA的形成受阻，保護(hù)能力下降，這與APX活性在長(zhǎng)期石油污染后顯著降低的現(xiàn)象相吻合。GSH可直接或通過Halliwell－Asada途徑間接清除H2O2，猝滅單線態(tài)氧及其他自由基，防止膜脂過氧化，并修復(fù)自由基損傷[12]。在5～15g／kg濃度石油污染下，GSH在處理30d時(shí)較對(duì)照顯著降低（圖2B），但60～90d時(shí)，其含量與對(duì)照無顯著差異，表明在上述濃度下，刺槐苗木GSH保護(hù)機(jī)制在較長(zhǎng)時(shí)段內(nèi)對(duì)石油污染產(chǎn)生適應(yīng)；在20 g／kg石油濃度下，GSH含量對(duì)石油污染的抗性更為明顯：處理30d時(shí)，GSH含量即可保持對(duì)照水平，而在60～90d時(shí)則較對(duì)照顯著增加（增幅達(dá)24.87%～36.86%），表明在該污染濃度下，GSH保護(hù)機(jī)制的反應(yīng)更加迅速，且強(qiáng)度更大。

圖2 石油污染對(duì)刺槐抗氧化劑的影響

Car可直接猝滅單線態(tài)氧，或間接猝滅三線態(tài)葉綠素阻止其產(chǎn)生，從而保護(hù)葉綠素[13]。在5g／kg濃度石油處理下，刺槐苗木Car含量在30d時(shí)與對(duì)照差異不顯著（圖2C），60d時(shí)較對(duì)照顯著提高，90d時(shí)則顯著降低；石油濃度為10～15g／kg，處理30d時(shí)Car含量變化不顯著，石油濃度達(dá)到20g／kg時(shí)則較對(duì)照顯著增加（增幅為25.92%），除石油濃度為5 g／kg處理60d時(shí)Car含量較對(duì)照顯著增加外，其他濃度石油處理60～90d時(shí)，Car含量均則較對(duì)照顯著降低（降幅達(dá)12.42%～33.98%）。上述結(jié)果表明短時(shí)段內(nèi)Car對(duì)石油污染具有一定抗性，且表現(xiàn)出應(yīng)激增加的現(xiàn)象，但隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，刺槐苗木Car維持能力受到明顯破壞。

2.3 石油污染處理下刺槐苗木H2O2和MDA含量的變化

脅迫環(huán)境下植物產(chǎn)生的活性氧往往超過其活性氧清除系統(tǒng)能力范圍，導(dǎo)致H2O2等產(chǎn)生積累，對(duì)蛋白質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。除在15g／kg濃度下，60d時(shí)較對(duì)照差異不顯著外，幾乎所有石油濃度下，處理30～60d時(shí)刺槐苗木H2O2含量均較對(duì)照顯著提高（圖3A），增幅可達(dá)192.00%；處理90d時(shí)，石油濃度為5，15g／kg下H2O2含量均較對(duì)照顯著降低，而濃度為10，20g／kg下雖仍較對(duì)照顯著增加，但增幅明顯變小（46.41%～57.60%）。試驗(yàn)結(jié)果表明H2O2含量對(duì)石油污染敏感，在較低污染程度下即顯著增加，且除部分處理較對(duì)照顯著降低外，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)基本高出正常水平，對(duì)植物生理過程造成長(zhǎng)期干擾，但其同時(shí)受到抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的有效抑制。MDA是活性氧積累導(dǎo)致膜脂過氧化作用的典型產(chǎn)物，故常用于評(píng)價(jià)活性氧造成的膜傷害程度。本試驗(yàn)中，4種石油污染程度下，處理時(shí)間為30～90d時(shí)刺槐苗木MDA含量均顯著等于或低于對(duì)照水平（圖3B）。該結(jié)果表明，盡管在石油污染下刺槐苗木體內(nèi)活性氧水平有明顯提高，但在抗氧化保護(hù)系統(tǒng)作用下并未對(duì)膜結(jié)構(gòu)造成實(shí)質(zhì)性的損傷。

圖3 石油污染對(duì)刺槐苗木H2O2和MDA含量的影響

3 討論與結(jié)論

植物體在受到脅迫時(shí)，體內(nèi)往往產(chǎn)生大量活性氧，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、生物膜發(fā)生損害。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物形成了完備的活性氧清除系統(tǒng)從而對(duì)各種環(huán)境脅迫進(jìn)行適應(yīng)和抵抗。通常情況下，適度的逆境處理可以提高保護(hù)酶系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)抗逆性。隨脅迫程度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，造成植物體活性氧產(chǎn)生量增加，同時(shí)降低保護(hù)酶活性和抗氧化劑含量，引發(fā)膜脂過氧化以及蛋白質(zhì)、DNA等的損傷。

弓曉峰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在石油污染20d時(shí)，1%～10%濃度石油處理下，玉米SOD的活性均顯著提高，APX活性顯著下降且隨濃度增加降幅趨于明顯，MDA含量顯著提高。李春榮等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨石油濃度增加，黃豆SOD活性先升后降，而MDA在高濃度下顯著增加。與上述結(jié)果相反，本試驗(yàn)的結(jié)果則表明，各石油污染濃度處理30d后，除APX外其他保護(hù)酶活性基本出現(xiàn)顯著降低，同時(shí)MDA含量則顯著低于對(duì)照，這可能是由于植株因分解有毒物質(zhì)消耗了大量的保護(hù)酶活性，而MDA產(chǎn)生量因毒害物質(zhì)減少而降低[16]。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度石油污染處理30d時(shí)AsA和Car含量顯著增加，這表明短期內(nèi)，盡管刺槐苗木受到石油污染影響，體內(nèi)出現(xiàn)H2O2積累，但其抗氧化劑含量仍能維持較高水平以抵消活性氧含量的增加，降低生物膜所受到的實(shí)際傷害。且刺槐抵御活性氧脅迫的機(jī)制與玉米不同，更加傾向于維持非酶抗氧化劑的含量而非抗氧化保護(hù)酶系的活性。出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是由于土壤水分和氮素有效性對(duì)刺槐抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的組分均具有一定的影響[17]，而石油污染對(duì)土壤水分和氮素有效性存在顯著相關(guān)性，不同程度的石油污染即可通過影響土壤氮素而間接對(duì)抗氧化保護(hù)酶和抗氧化劑產(chǎn)生作用。此外，石油還可能影響到刺槐苗木根系的生長(zhǎng)狀況、體內(nèi)激素水平和其他的生化代謝途徑，從而增加石油脅迫結(jié)果的復(fù)雜性。同時(shí)，考慮到不同試驗(yàn)使用的石油成分存在一定的差異，其毒性物質(zhì)的含量必然也有所不同，這可能是引起不同試驗(yàn)間結(jié)果變異的重要原因之一。

隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，SOD活性在各濃度下均能維持或高于對(duì)照水平，CAT活性僅在濃度為5～10 g／kg下90d時(shí)顯著低于對(duì)照，其余則仍高于或持平于對(duì)照水平，APX和GR活性則均顯著低于同期對(duì)照水平，且隨石油濃度增加降幅顯著增大；AsA和GSH含量在中長(zhǎng)期石油污染下仍能維持正常水平，在20g／kg下甚至顯著增加。Car含量則在石油濃度≥10g／kg下處理60～90d時(shí)，較對(duì)照顯著降低。說明在長(zhǎng)期石油污染下，刺槐抗逆機(jī)制由單一依靠抗氧化劑清除活性氧逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡趸Ｗo(hù)酶與抗氧化劑協(xié)同作用，其中SOD對(duì)石油脅迫的適應(yīng)能力最強(qiáng)，CAT活性以及AsA和GSH對(duì)脅迫的適應(yīng)能力相對(duì)較弱，但在各濃度石油持續(xù)處理下仍可維持較高水平，這可能是由于H2O2積累對(duì)上述抗氧化保護(hù)物質(zhì)產(chǎn)生了一定的誘導(dǎo)。而APX、GR活性和Car則在長(zhǎng)期石油污染處理下遭到嚴(yán)重破壞，其降低程度與石油濃度正相關(guān)。這可能與不同酶和抗氧化保護(hù)物質(zhì)本身的特性有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。另外，刺槐苗木各時(shí)期的生理指標(biāo)受影響的程度很少呈現(xiàn)明顯的濃度—指標(biāo)響應(yīng)關(guān)系（同期高濃度石油污染并未造成更明顯脅迫），這可能是由于石油濃度增加的同時(shí)，其中主要毒性成分的積累越過了刺槐苗木的耐受閾值，而在多種毒性成分綜合作用下產(chǎn)生復(fù)雜的脅迫現(xiàn)象。此外，石油長(zhǎng)期污染下其中間代謝產(chǎn)物的作用也對(duì)其脅迫效果產(chǎn)生影響[17]，其機(jī)理也尚需進(jìn)一步的研究闡釋。

盡管在5～20g／kg石油脅迫下刺槐苗木體內(nèi)H2O2產(chǎn)生量顯著增加，但膜脂過氧化產(chǎn)物MDA在5～20g／kg濃度下始終維持在或者顯著低于同期對(duì)照水平，這與岳冰冰等[18]的研究結(jié)果相似，表明在抗氧化保護(hù)系統(tǒng)在較高濃度石油污染下能快速做出響應(yīng)，使活性氧造成的膜損傷顯著降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，刺槐苗木抗氧化保護(hù)系統(tǒng)對(duì)20g／kg以內(nèi)的石油脅迫具有較強(qiáng)且長(zhǎng)期的抗逆響應(yīng)。

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