，*

（1.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津科技大學(xué)，天津 300222）

豆粕是大豆榨油的副產(chǎn)物，一般用做飼料。豆粕蛋白含量很高，以其為底物，用酶解法可以制備具有降血壓作用的ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制肽[1]。ACE 對血壓起著重要的調(diào)節(jié)作用，它可以水解血管緊張素I（Angiotensin I，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Pro-His-Leu），生成的血管緊張素II具有升高血壓作用，同時(shí)還可以水解舒緩激肽（Bradykinin，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Arg），使其失去降壓作用[2]。中國高血壓防病指南將血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）明確列為五種最常用的降壓藥物之一[3]，自1977年ACEI問世以來已成為防治心血管疾病的“基石”藥物[4]。有關(guān)試驗(yàn)表明，人工合成的ACE抑制劑會(huì)產(chǎn)生一些副作用，而食品級蛋白源降壓肽由于其安全性很高，只對高血壓患者起到降壓效果，對血壓正常者無降壓作用，且降壓作用平穩(wěn)而溫和。因此，具有降壓作用的大豆ACE抑制肽備受關(guān)注[5-6]，但以食品級豆粕為原料制備ACE抑制肽的研究相對較少。開發(fā)大豆降壓食品不僅可以為心腦血管病患者提供一種物美價(jià)廉，安全可靠的保健食品還可以大幅度提高大豆產(chǎn)品的附加值，拓寬大豆的用途。同時(shí)，伴隨生物技術(shù)的不斷進(jìn)步與生命科學(xué)的巨大發(fā)展，人們發(fā)掘出越來越多有關(guān)大豆多肽的功能，而某些抑制肽的結(jié)構(gòu)與生理功能也逐漸被人們所認(rèn)識和了解，推動(dòng)了人類對大豆抑制肽進(jìn)行研究與開發(fā)[7]。據(jù)此，實(shí)驗(yàn)以食品級大豆粕為原料制備具有降血壓作用的大豆多肽并對其性質(zhì)和ACE抑制活性進(jìn)行研究，為大豆降壓肽的開發(fā)應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用級豆粕：市購；堿性蛋白酶：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；硼酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硼砂（分析純）：天津市元立化工有限公司；三氟乙酸（分析純）：上海市科豐試劑廠；甲醇（色譜純）：美國迪馬科技公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippury-L-histidyl-L-leucine，Hip-His-Leu）：美國sigma公司；ACE（來自兔肺）：美國sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1200、超高壓液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配有電噴霧離子源（ESI）：美國安捷倫。

1.3 方法

1.3.1 酶解抑制肽樣品的制備

稱取豆粕，分別配制成20、40和60 g/L水溶液，50℃恒溫?cái)嚢?0 min。1 mol/L NaOH調(diào)pH8.0，同時(shí)加入3%（E/S）的堿性蛋白酶。為保證溶液pH穩(wěn)定，需不斷向體系加入NaOH，同時(shí)記錄加入量，用于計(jì)算水解度。分別于 1、2、3、4、5、6、9、12 h 取樣，立即于 90 ℃水浴15 min，鈍化蛋白酶。流水冷卻后4℃12 500 r/min離心15 min，取上清液凍干得到抑制肽樣品。

水解度的測定采用pH-STAT法[8]。

1.3.2 色譜及質(zhì)譜儀器條件、

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax300SB-C18，5 μm，4.6×150 mm；檢測波長：228 nm，流動(dòng)相：50%甲醇-超純水，各含0.1%的三氟乙酸；流速：0.7 mL/min；柱溫：26℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2.1 色譜條件

離子源：ESI；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；正離子模式下噴霧毛細(xì)管電壓為4.0 KV，霧化氣為N2氣流量為11 L/min，干燥氣壓力為45 Pa，IT 真空為 2.8×10-5Tor；TOF 真空為 2.56×10-7，干燥氣溫度為200℃，質(zhì)譜采集范圍m/z 50-3000。

1.3.3 ACE抑制肽活性檢測方法

1.3.3.1 試劑的配制

1）馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液：取一定量的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，加去離子水溶解配成濃度為25 μg/mL的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，并逐級稀釋成一系列濃度 20、15、10、5、2、1、0.5、0.1 μg/mL。

2）硼酸緩沖液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）：溶液A：稱取硼酸3.092 5 g，用去離子水溶解定容至500 mL；溶液B：稱取硼砂4.767 5 g，用去離子水溶解定容至500 mL；取 A 液 120 mL，B 液 80 mL，NaCl 3.51 g，混合至完全溶解，即為0.1 mmol/L的硼酸緩沖溶液。

3）ACE溶液：將0.25 U ACE溶于2.5 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）即得。

4）HHL溶液（5 mmol/L）：取適量 HHL 溶解于0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液（pH8.3含0.3 mol/L NaCl）中，配置成5 mmol/L HHL溶液。

5）稱取適量冷凍干燥后的抑制肽粉末，將其溶于一定量的0.1 mol/L硼酸緩沖溶液（pH8.3，含0.3 mol/L NaCl）中，制成0.5 mg/mL抑制肽溶液。

1.3.3.2 ACE抑制肽活性測定

反應(yīng)體系總體積為120 μL。

測定管：取抑制肽樣品60 μL與ACE溶液10 μL混合，37℃水浴10 min后加入HHL溶液50 μL；整個(gè)反應(yīng)體系37℃水浴60 min后加入1 mol/L HCL 100 μL終止反應(yīng)；過0.45 μm濾膜，進(jìn)行液相色譜分析。

對照管：用60μL硼酸緩沖液（pH8.30.3mol/LNaCl）替代測定組抑制肽溶液，用同樣方法制備反應(yīng)液。

空白對照管：用10 μL硼酸緩沖液（pH8.3 0.3 mol/L NaCl）替代對照組ACE溶液，同樣方法制備反應(yīng)液（平行3次）。

計(jì)算公式為 ACE 抑制率（%）=（[HA] c–[HA] s）/（[HA] c–[HA] H）×100%

式中：[HA] c：對照樣品馬尿酸濃度；[HA] s：測定樣品馬尿酸濃度；[HA] H：空白對照中馬尿酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的測定

分別以0.1mol/L的硼酸緩沖液（pH8.3，含0.3mol/L NaCl）和去離子水為參比，在190 nm～300 nm波長處掃描馬尿酸溶液和HHL溶液的紫外吸收光譜，如圖1所示。

圖1 馬尿酸與HHL紫外吸收光譜Fig.1 UV scanning spectrum of hippuric acid and HHL

從圖可以看出三肽HHL在210 nm～250 nm波長范圍內(nèi)有一定的吸收，而馬尿酸在228 nm波長處有一特征吸收峰。因此可以用228 nm作為HPLC的檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇及保留時(shí)間的確定

在1.3.2.1節(jié)選定的條件下馬尿酸及HHL的液相色譜圖如圖2和圖3所示。

圖2 HHL液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of HHL

圖3 馬尿酸液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of hippuric acid

此色譜條件下，樣品、馬尿酸、HHL能夠?qū)崿F(xiàn)很好的區(qū)分，各峰區(qū)分度較好，馬尿酸峰能和其它峰獨(dú)立區(qū)分不受干擾。對加樣品后的多組反應(yīng)液檢測后，馬尿酸的峰面積減小，且出峰時(shí)間也很穩(wěn)定。HHL的保留時(shí)間為Rt=6.168 min，馬尿酸的保留時(shí)間為Rt=3.023 min。

2.3 抑制肽活性測定結(jié)果

2.3.1 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

將配置好的不同濃度的馬尿酸溶液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行液相分析，結(jié)果表明馬尿酸的峰面積（mAU·S）及其濃度C（μg/mL）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程是：y=92.695 8x-13.91，如圖4所示。

圖4 馬尿酸峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of hippuric acid

因此，馬尿酸的峰面積可以很好的反映體系中馬尿酸的濃度，進(jìn)一步體現(xiàn)出ACEI的抑制活性。試驗(yàn)中所有樣品反應(yīng)體系中馬尿酸的濃度全部在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

2.3.2 不同底物濃度的酶解產(chǎn)物ACE抑制效果

隨著底物濃度的增加，酶解大豆肽的活性略有升高，并且同時(shí)在3 h時(shí)獲得最高活性產(chǎn)物。但是考慮到生產(chǎn)成本以及前期處理和后期分離濃縮的困難，應(yīng)盡量提高底物濃度。綜合考慮下，確定40 g/L底物濃度下進(jìn)行水解較適宜。（見圖5）

圖5 堿性蛋白酶制備的ACE抑制肽活性Fig.5 Inhibition of ACE peptide made by alcalase

2.3.3 水解度與ACE抑制活性關(guān)系

圖6 水解度與抑制率的關(guān)系Fig.6 The diversification for DH and ACE inhibitory ratio

從圖6可以看出，在水解反應(yīng)的0 h～9 h內(nèi)，水解度一直呈上升的趨勢。在水解的初始階段0 h～3 h，ACE抑制肽活性隨著水解度的增加而增強(qiáng)[9]，隨后便逐漸下降。這是因?yàn)樵谒夥磻?yīng)的后期，ACE抑制肽被水解成小分子的氨基酸，使得其活性被破壞。因此酶解3 h的產(chǎn)物活性最高，為64.21%，對應(yīng)水解度14.86%。這與Mullally[10-11]等的研究結(jié)果是一致的，他認(rèn)為在酶解反應(yīng)初始階段，ACE抑制肽被大量生成，但之后被逐步降解，從而導(dǎo)致ACE抑制活性下降。

2.4 高活性肽性質(zhì)初步分析及測定

很多具有生理活性的生物活性肽都與其分子量有一定的關(guān)系[12]。為了明確酶解產(chǎn)物所含物質(zhì)的分子量，對ACE抑制活性最高的3 h酶解產(chǎn)物進(jìn)行液質(zhì)分析，結(jié)果如圖7。

圖7 堿性蛋白酶3 h酶解產(chǎn)物L(fēng)C-MS離子峰Fig.7 LC-MS ion peak of the alcalase hydrolysates（3 h）

結(jié)果顯示樣品中主要含有兩種主要物質(zhì)，分子量分別為 359和 441，對應(yīng)分子式為 C15H30N6O4和C24H36N6O2。經(jīng)SciFinder檢測顯示C15H30N6O4是三肽物質(zhì)，由異亮氨酸、精氨酸和丙氨酸構(gòu)成[13-14]。

3 結(jié)論

在pH8.0，溫度50℃，底物濃度40 g/L的條件下，食品級豆粕經(jīng)堿性蛋白酶水解3 h產(chǎn)生的ACE抑制肽活性最高為64.21%，對應(yīng)水解度14.86%。Lin等從魷魚皮膚胃蛋白酶水解肽中獲得的分子量小于2 KDa的物質(zhì)，其ACE抑制IC50值為0.33mg/mL[15]。小麥胚芽蛋白脫脂后的酶解物ACE抑制IC50值0.452 mg/mL[16]。與已有文獻(xiàn)報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)條件下所制備的0.5mg/mL ACE抑制肽表現(xiàn)出了相當(dāng)ACE抑制活性，經(jīng)液質(zhì)檢測其中含有的三肽物質(zhì)為C15H30N6O4。因此，本研究為開發(fā)食品級豆粕作為具有抗高血壓作用的保健食品提供了理論依據(jù)，具有很大的發(fā)展前景。

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