黃伶俐 杜曉華 穆金艷 陳宏志 劉會超

(河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng)，453003)

大花三色堇熱激蛋白70(HSP70)基因片段的分離1)

黃伶俐 杜曉華 穆金艷 陳宏志 劉會超

(河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng)，453003)

為了獲得三色堇耐熱性相關(guān)的基因HSP70基因，根據(jù)GenBank上登錄的擬南芥、陸地棉等HSP70基因序列設(shè)計引物，用同源克隆法分離出大花三色堇HAR的HSP70基因片段，并進(jìn)行測序與比對。結(jié)果表明：克隆得到基因片段，長度為882 bp，其序列與已公布的幾種植物HSP70的編碼區(qū)相似率平均為85.1%，上游引物含于基因片段中。初步證明此基因片段為三色堇HSP70基因片段。

大花三色堇；HSP70基因；基因克??；序列分析

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-105～107

In order to obtain the heat resistance gene HSP70 ofViola×wittrockiana, the primers were designed based on the sequence of the HSP70 gene sequences ofArabidopsisthaliana,Gossypiumhirsutumand other plants in GenBank. The HSP70 gene fragment of pansy HAR were cloned by homology cloning and the fragment was sequenced. The length of gene fragment of HAR were 882 bp, the gene sequence shared 85.1% similar rate with the CDS of HSP70, and the forward primer was included in the fragment. The results provided evidence that the gene fragment were the HSP70 of pansy HAR.

KeywordsViola×wittrockiana; HSP70gene; Gene cloning; Sequence similarity

大花三色堇(Viola×wittrockiana)，又名蝴蝶花、貓臉花和鬼臉花等，其品種繁多且色彩鮮艷，花期長且耐寒，有“花壇皇后”的美譽(yù)，是我國重要的花壇和盆栽花卉，在我國廣泛栽培[1]。一般大花三色堇品種不耐高溫，在華北地區(qū)超過35 ℃，植株生長不良并逐漸死亡。HAR為近年本課題組發(fā)現(xiàn)的特有耐熱三色堇種質(zhì)。

雖然植物的抗熱性是受多基因控制的復(fù)雜性狀，但近年在植物體中發(fā)現(xiàn)的熱激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)被證明與植物的抗熱性成正相關(guān)，在生物抵御熱脅迫中發(fā)揮著重要作用[2-4]。熱激蛋白是生物體在外界溫度突然升高5～10 ℃時(熱激)迅速合成的一種特有蛋白。根據(jù)對昆蟲、鳥類、魚類、哺乳類、植物以及細(xì)菌、酵母等多種生物的研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激是生物體遭受脅迫時，正常蛋白的合成受阻，而一系列HSP合成的過程[5]。其中，HSP70作為分子伴侶能阻止熱傷害的變性蛋白聚集，并幫助其恢復(fù)到正常構(gòu)象。生物體自身耐受性獲得的速度與HSP積累速率呈正相關(guān);耐受性的降低與HSP的降解同步[2，6-8]。熱激蛋白的合成受控于特定的基因，目前已從擬南芥、陸地棉等植物分離到了編碼該蛋白的基因。三色堇耐熱種質(zhì)HAR是否含有HSP70基因，其HSP70基因有什么特點(diǎn)，是值得探索的問題。為此，本研究試圖從耐熱三色堇種質(zhì)HAR中分離出HSP70基因，并進(jìn)行序列分析，為揭示三色堇耐熱分子機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

大花三色堇品種HAR，由河南科技學(xué)院三色堇育種實(shí)驗(yàn)室提供，該材料從荷蘭Buzzy種選育所得，耐熱性好能越夏，花期4—6月份，花色為紫紅色。

主要試劑:PCR引物合成(上海生工生物工程公司)，柱式植物RNAout Kit(北京天恩澤公司)，Quantscript RT Kit(天根Tiangen公司)，Taq DNA Polymerase(天根Tiangen公司)，Gel Extraction Kit(Omega公司)。

總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成：以育苗室培育4個月的HAR植株作為試驗(yàn)株，于生化培養(yǎng)箱內(nèi)40 ℃熱激20、35、50、60 min(恢復(fù)10 min)，按照柱式植物RNAout Kit試劑盒說明書的步驟分別取幼葉提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度。

按照Quantscript RT Kit試劑盒說明書的反轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，獲得第一鏈cDNA。

HSP70基因片段的獲得：將擬南芥、陸地棉、蓖麻等幾種植物中已公布的HSP70序列進(jìn)行比對，以同源性最高的一段CDS編碼區(qū)設(shè)計一對引物，上游引物：GTT ACA GTT CCT GCT TAT TTC，下游引物：TAG ACC TGG ATC AGT ACA CC。此對引物的解鏈溫度Tm值為56 ℃，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物為905 bp。

按照Taqase說明書設(shè)置HSP70基因片段的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，由梯度PCR試驗(yàn)得出此對引物最佳退火溫度為50.3 ℃。HSP70基因片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，目標(biāo)片段長度為900 bp左右，認(rèn)定為目的片段，將100 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，按照Gel Extraction Kit說明書步驟進(jìn)行膠回收，獲得40 μL純化產(chǎn)物，純化產(chǎn)物5 μl用于電泳檢測，目的條帶清晰。直接將回收產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序。

大花三色堇HSP70基因片段的同源性：利用DNAStar軟件對所測序列進(jìn)行比對分析，將模板編碼區(qū)序列在Editseq功能中保存為seq格式，樣本測序后本身為seq保存格式，便于比對時插入比對框；在序列比對軟件中將2個需要比對的序列通過輸入序列添加進(jìn)比對框，點(diǎn)擊Align進(jìn)行相似性比對。并將大花三色堇HSP70基因片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對功能區(qū)中與GenBank中已有的HSP70序列進(jìn)行相似性比對，輸出結(jié)果要求為高度相似序列。一些相似性比較低而不在結(jié)果中顯現(xiàn)的則在DNAStar的序列比對功能區(qū)進(jìn)行比對操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP70基因片段的獲得

植物RNAout Kit提取HAR的總RNA,電泳檢測(圖1)，RNA 18 s和28 s兩條帶清晰明亮，雖有少量DNA殘留，但不影響PCR擴(kuò)增；根據(jù)已登錄的幾種植物的HSP70基因序列，用DNAStar軟件比對出100%相似的一段編碼區(qū)，以此段序列設(shè)計引物，并以HAR的總RNA為模板經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得長度約為900bp的DNA片段(圖2)。

M.DL-2000標(biāo)記；1、2.RNA提取物。

2.2 HSP70基因片段序列分析

利用DNAStar分析軟件對HSP70基因片段序列進(jìn)行分析可知，HSP70基因片段總長882 bp，將其與設(shè)計引物所選取得編碼區(qū)序列進(jìn)行比對，從281—878 bp處有598 bp堿基的相似率為85.1%；上游引物存在于一條鏈的854—876 bp處，引物21 bp的相似率為95.2%,證明所獲片段是由目的引物分離得到。由于三色堇與參考植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，85.1%的相似率基本確定為該基因片段為三色堇HAR的HSP70基因片段。

M.DL-2000標(biāo)記；1.HSP70PCR產(chǎn)物；2.空白對照。

2.3 大花三色堇HSP70基因片段與不同物種的相似性

通過NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對以及DNAStar中的序列比對軟件所得的結(jié)果可知，不同植物之間HSP70基因相似率很高：三色堇HSP70基因與所比對的序列期望值(E值)都為0，表明與所比較的基因序列完全匹配；三色堇HSP70基因片段與煙草、陸地棉、南瓜、亞洲水稻、擬南芥和湖北海棠等達(dá)到86%以上的相似率，且能達(dá)到80%以上相似率的全為植物HSP70基因，而非植物類的常見物種如老鼠、果蠅、酵母菌和白色念珠菌的HSP70基因與三色堇HSP70基因相似率比較低(表1)，說明HSP70基因在不同物種的進(jìn)化中根據(jù)環(huán)境和自身適應(yīng)性而有所變化，但總體而言，HSP70基因在植物中相當(dāng)保守。

表1 三色堇HAR HSP70基因片段與不同物種HSP70基因編碼區(qū)序列相似性

物種名稱類型基因序列號E值相似率/%煙草NtHsp70mRNAAB689673.1089陸地棉SpotW20mRNAFJ415194.1088南瓜Hsc70-3mRNAAF527796.1088亞洲水稻hsp70DNAX67711.2087擬南芥hsc70-1DNAX77199.1087湖北海棠HSP70mRNAHQ876864.1086家鼠Hspa1bDNA15511071白色念珠菌HSP70DNA3636229061黑腹果蠅Hsp70AaDNA48581050樹干畢赤酵母HSP70.3DNA14541952040

3 結(jié)論與討論

HSP70在生物體內(nèi)分布極為廣泛，存在于古生菌、真核細(xì)菌和真核生物等幾乎所有的生物體中[9]，也是目前研究的最為深入的一種熱激蛋白。起主要作用的HSP多由核基因編碼成蛋白質(zhì)，并分布在細(xì)胞的不同部位如細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?；诟鱾€亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)不同及其調(diào)控反應(yīng)的不同，編碼各個HSP70的基因就有所不同，各種HSP70蛋白之間存在著差異[10]，擬南芥有HSP70-4和hsp70T-2兩個變體，玉米有hsp70-1和hsp70-4兩個變體，小麥有hsp70和Tahsp70d兩個功能相似性伴侶。生物體內(nèi)，HSP的誘導(dǎo)極其快速和顯著，其對生物體的保護(hù)作用是多種分子伴侶蛋白網(wǎng)絡(luò)式協(xié)同作用的結(jié)果。各種HSP在保護(hù)細(xì)胞免受外界脅迫的過程中相輔相成，有時甚至達(dá)到疊加效應(yīng)。HSP70與其他分子伴侶協(xié)同參與抗脅迫一系列機(jī)制中的膜及蛋白的修復(fù)與保護(hù)和自由基及有毒化合物的清除[4]等反應(yīng)。HSP70基因在一種保守蛋白熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat Shock Factor,HSF)的調(diào)控下，根據(jù)脅迫情況的差異編碼相應(yīng)功能的HSP70,表達(dá)的HSP70幫助恢復(fù)和保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)整個植株[11]。

HSP70基因已經(jīng)從擬南芥、水稻、玉米和芍藥等多種植物中分離出來并且加以分析，HSP70基因一般5’端有100 bp左右的非翻譯區(qū)，3’端有200 bp的非翻譯區(qū)，中間的開放閱讀框(Open-Reading Frame，ORF)包含大約2 000 bp堿基用于編碼HSP70蛋白[12-14]。植物的ORF框分為兩類，一類含有內(nèi)含子，如玉米、牽?；ǖ鹊腛RF框；而另一類則無內(nèi)含子，如大豆、胡蘿卜等的ORF框[15]。在HSP70基因的ORF上游通常存在基因調(diào)控區(qū)，包含多個熱激元件(Heat Shock Elements,HSEs)，還有一些類似HSE的元件，其功能是與熱激因子(HSF)結(jié)合調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻谋磉_(dá)[16]。目前，三色堇關(guān)于分子方面的研究比較少，只涉及一些小分子，HSP70方面尚未有基因序列在Genbank中登陸，鑒于HSP70的高度保守性，本研究從擬南芥、陸地棉等植物的HSP70入手，利用同源序列克隆法，以植物同源HSP70基因保守區(qū)為模板，設(shè)計特異引物，通過PCR技術(shù)克隆出三色堇片段,其長度為882 bp，序列分析顯示其序列與作為模板的擬南芥HSP70-4的部分序列的相似率為85.1%。NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast功能軟件比對顯示其與煙草的NtHSP70mRNA相似率為89%，與陸地棉、南瓜的mRNA相似率為88%，與家鼠的DNA相似性為71%，與果蠅的DNA相似性為50%，經(jīng)過相似性比較可知不同物種之間HSP70基因有所差異，且親緣關(guān)系越遠(yuǎn)差異越大。盡管在進(jìn)化過程中存在著諸多如亞細(xì)胞器調(diào)控過程的變化或者一個簡單獨(dú)立的生化反應(yīng)發(fā)生變異導(dǎo)致HSP70基因有所變異，總體而言，植物中HSP70基因保持著高度的穩(wěn)定性。根據(jù)HSP70基因序列的特點(diǎn)以及堿基的相似率等初步判定所得基因片段為三色堇HSP70基因片段，該基因片段的獲得為后續(xù)的克隆三色堇HSP70的全長和分析其生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning of Gene Fragment of HSP70 inViola×wittrockiana/

Huang Lingli, Du Xiaohua, Mu Jinyan, Chen Hongzhi, Liu Huichao(Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, P. R. China)//

黃伶俐，女，1987年9月生，河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，碩士研究生。

劉會超 ，河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，教授。E-mail:huichaoliu2012@163.com。

2013年11月25日。

Q343.1+1

1) 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102110119)、河南省科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(13B210009)。

責(zé)任編輯：任 俐。