倪文凱，于東風(fēng)，劉 弋

凋亡是正常機(jī)體細(xì)胞保持穩(wěn)定的重要措施之一，是調(diào)節(jié)機(jī)體組織平衡的重要機(jī)制，是一個(gè)受到嚴(yán)密監(jiān)控的過(guò)程?；虻漠惓８淖儠?huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［1］。凋亡抑制蛋白Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，特異的高表達(dá)于某些實(shí)體腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中［2］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)是一種促凋亡因子，是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族中的一員，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類之一［3］。為了研究?jī)烧邔?duì)十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，該研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)十二指腸腺癌中兩者的表達(dá)情況，旨在探討二者在十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用，從而為十二指腸腺癌的診斷與臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集我院2006年1月～2012年12月經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理驗(yàn)證的有完整臨床資料的十二指腸腺癌患者的存檔組織蠟塊60例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男32例，女28例，年齡36～84歲，平均45.4歲。所有患者術(shù)前均未接受化療及放療。同時(shí)選取同組病例癌旁正常組織標(biāo)本30例作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin多克隆抗體及兔抗人Caspase-9多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;通用型二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6000)、PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液、DAB顯色液等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化PV-6000兩步法。每次染色均設(shè)立陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，(以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照)。結(jié)果判斷:Livin以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。Caspase-9以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。選擇合適部位選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，以＞20%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組之間比較相關(guān)性檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)r。

2 結(jié)果

2.1 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織均有陽(yáng)性表達(dá)，其中Livin在實(shí)驗(yàn)組中的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，Caspase-9在實(shí)驗(yàn)組中的陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 Livin、Caspase-9在十二指腸腺癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Livin的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Caspase-9的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位及浸潤(rùn)深度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 Livin與Caspase-9在十二指腸腺癌中表達(dá)相關(guān)性分析 43例Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)的十二指腸腺癌組織中7例Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性，17例Livin蛋白陰性的十二指腸腺癌中有8例Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性。Livin與Caspase-9的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，r=－0.320)，見(jiàn)表3。兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。

表1 Livin在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況［n(%)］

圖1 十二指腸腺癌及癌旁正常組織中Livin及Caspase-9的表達(dá) SP×400

表2 Livin、Caspase-9的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系［n(%)］

表3 十二指腸腺癌中Livin與Caspase-9表達(dá)之間的關(guān)系［n(%)］

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的生理過(guò)程，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著關(guān)鍵的作用。細(xì)胞凋亡功能的異常最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長(zhǎng)4 600 bp，包含6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子。其編碼的Livin蛋白含有IAP家族成員中特有的BIR結(jié)構(gòu)和RING指結(jié)構(gòu)。其中RING結(jié)構(gòu)調(diào)控著Livin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合理分布，BIR結(jié)構(gòu)是Livin蛋白發(fā)揮抗凋亡作用的重要結(jié)合部位，通過(guò)與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 以及凋亡前體蛋白SMAC等酶的結(jié)合，達(dá)到阻斷凋亡受體以及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用［4］。Yagihashi et al［5］通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌癥患者血清中抗Livin抗體，發(fā)現(xiàn)肺癌、乳腺癌、腎癌、食管癌、胃癌、膽管癌和結(jié)直腸癌患者血清中抗Livin抗體高表達(dá) 。Xi et al［6］用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者中Livin呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Livin在對(duì)照組中低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，并與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示Livin表達(dá)的升高可能與十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)系，同時(shí)Livin的表達(dá)可能影響十二指腸癌的生物學(xué)行為，使其發(fā)生轉(zhuǎn)移等惡性轉(zhuǎn)化行為，有可能成為癌癥預(yù)后及治療情況的判斷指標(biāo)之一。

Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，線粒體釋放Cyt C及凋亡活化因子(Apaf-1)。兩者結(jié)合以后形成凋亡小體，共同激活Caspase-9，活化后的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)Caspase，從而參與調(diào)節(jié)過(guò)程［7］。本研究顯示Caspase-9在實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于對(duì)照組，并且與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)。提示Caspase-9的異常表達(dá)參與了十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

Kasof et al［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明:Livin 能夠直接抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的水解作用，Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)能夠與Caspase結(jié)合從而抑制其功能。同時(shí)Livin還能直接在凋亡的起始點(diǎn)干擾Procaspase-9或者直接干擾Caspase-9的活性［9］。本研究表明Livin與Caspase-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。Livin蛋白和Caspase-9的具體作用機(jī)制以及兩者之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。二者的聯(lián)合檢測(cè)可視為判斷患者預(yù)后以及治療效果的重要標(biāo)志和預(yù)測(cè)因子。

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