鄧?guó)Q，朱斌

（廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧530021）

人參蜂王漿口服液是以人參、蜂王漿、五味子、蜂蜜等為主要原料制成的保健食品，經(jīng)功能試驗(yàn)證明具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老的保健功能[1]。其中蜂王漿和蜂蜜是具有保健作用的蜂產(chǎn)品，它們富含維生素、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、酶類、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成份，具有調(diào)節(jié)生理機(jī)能、消炎殺菌、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗腫瘤、防衰老、增強(qiáng)免疫力等功效，蜂產(chǎn)品作為原輔料廣泛用于食品、保健食品及藥品中，它的質(zhì)量也影響到了成品的質(zhì)量安全。在蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中，蜂農(nóng)往往在飼料中添加藥物用以防治蜂群染病，如四環(huán)素類藥物用于防治蜜蜂的白惡病、腐臭病；大環(huán)內(nèi)酯類藥物用于防治蜜蜂幼蟲病等。然而過(guò)量或不正確使用藥物會(huì)導(dǎo)致蜂產(chǎn)品中藥物殘留，長(zhǎng)期食用含有藥物的食品對(duì)人體功能有一定的損害，影響到人類的健康。目前，已有多種方法被報(bào)道用以檢測(cè)蜂產(chǎn)品中藥物殘留，方法主要有：微生物法[2]、分光光度法[3]、液相色譜法[4-5]和液質(zhì)聯(lián)用方法[6-8]等。檢測(cè)的藥物種類也從以前較單一發(fā)展成現(xiàn)在可同時(shí)進(jìn)行幾類或幾十種藥物殘留檢測(cè)的方法，其中液質(zhì)聯(lián)用方法因其具有良好的適用性、可同時(shí)定性定量功能及高靈敏度的特點(diǎn)，成為可同時(shí)檢測(cè)多種藥物殘留的主要檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類等15種藥物殘留，為更好的評(píng)價(jià)和控制人參蜂王漿的質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

1.1.1 儀器

Agilent 6460型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，配Agilent 1290型液相色譜儀：Agilent公司，美國(guó):；Milli-Q去離子水發(fā)生器：Milli-Q公司，美國(guó)；高速冷凍離心機(jī)：ttettich公司，德國(guó)；樣品自動(dòng)濃縮儀：Genevac公司，英國(guó)。

1.1.2 試劑與材料

林可霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素、紅霉素、氧氟沙星、阿奇霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、羅紅霉素，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。達(dá)氟沙星、恩諾沙星、二氟沙星購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其它試劑為分析純。Oasis HLB柱（500 mg/6 mL，waters公司）。

溶液的制備：對(duì)照品分別用甲醇配制成1.0 mg/mL儲(chǔ)備液，置于4℃保存，臨用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)液。

1.1.3 樣品

4批人參蜂王漿口服液樣品購(gòu)自本地藥店。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18（5μm，150×4.6mm）；流動(dòng)相：A：甲醇-乙腈（3 ∶2），B：0.1%甲酸，梯度洗脫程序：0～8 min（A：10%）；8 min～15 min（A：10%～30%）；15 min～16 min（A：30%～10%），流速為 0.5 mL/min。進(jìn)樣量 10 μL；柱溫 25℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：正離子掃描；干燥氣：氮?dú)?；干燥氣溫度?25℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化氣壓力：0.006Pa；鞘流氣溫度：400℃；鞘流氣流速：10 L/min。母離子、子離子、駐留時(shí)間、碎裂電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

1.3 樣品溶液的制備

稱取供試樣品約5 mL，置于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L EDTA溶液0.1 mL，再加入pH 8.0磷酸鹽緩沖液20 mL，混勻，渦旋2 min，以4 000 r/min的速率離心5 min，上清液置于另一離心管中，殘?jiān)偌尤雙H 8.0磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋2 min，以4 000 r/min的速率離心5 min，合并上清液，上清液以1 mL/min的速度通過(guò)活化后的固相萃取柱（固相萃取小柱依次用5mL甲醇，5 mL水活化），先用5 mL水淋洗兩次，再用5 mL甲醇洗脫（控制流速1 mL/min～2 mL/min。將洗脫液用自動(dòng)濃縮儀于45℃濃縮至干，用1.00 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)LC-MS/MS分析。

表1 15種藥物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameter of mass spectra of 15 Drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取凈化條件考察

蜂蜜中含有大量的糖份和其它有機(jī)物質(zhì)，因此需要通過(guò)采用適當(dāng)?shù)奶崛『蛢艋绞絹?lái)對(duì)樣品進(jìn)行處理，以便盡可能的減少干擾，提高分析靈敏度。本文考察了分別用pH 8.0磷酸鹽緩沖液、pH 8.0磷酸鹽緩沖液-甲醇（95∶5）、5%甲醇溶液、5%乙腈溶液對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行提取，結(jié)果采用pH 8.0磷酸鹽緩沖液提取加標(biāo)樣品時(shí)，各待測(cè)組份的回收率均較高。由于四環(huán)素類物質(zhì)易與金屬離子螯合，降低提取回收率，因此加入0.1 mol/L EDTA溶液0.1 mL，結(jié)果表明加入0.1 mol/L EDTA溶液可顯著提高四環(huán)素類被測(cè)物的回收率，且對(duì)其它組份沒(méi)有影響。

本文考察了使用不同類型固相萃取小柱（HLB、C18）凈化，不同的洗脫溶劑（甲醇、乙腈、乙酸乙酯）處理提取液的效果，結(jié)果表明采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，甲醇洗脫時(shí)大部分被測(cè)組份的回收率為最高。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相對(duì)待測(cè)組份的峰形、分離度有很大影響，分別考察了水相為含有0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液及有機(jī)相為甲醇、乙腈、甲醇和乙腈（3∶2）做為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇-乙腈（3∶2）-0.1%甲酸為流動(dòng)相做梯度洗脫時(shí)，各組份的分離度與峰形均較好。圖1為標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的提取離子流圖。

圖1 15種藥物混合溶液選擇離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of 15 drugs

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別在正離子模式下對(duì)各待測(cè)化合物進(jìn)行母離子全掃描，再對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，以各子離子的提取離子色譜峰峰高為指標(biāo)，對(duì)各子離子的碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化選擇。選擇兩個(gè)豐度最高的特征離子作為定性離子，并以其中豐度較高的子離子作為定量離子，最終分別確定各化合物定量離子和定性離子質(zhì)量數(shù)及質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 線性關(guān)系及檢測(cè)限

取對(duì)照品混合工作液配成一系列濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以化合物峰面積（Y）和對(duì)應(yīng)的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到15種藥物線性范圍為0.08 ng/mL～20 ng/mL，線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限見(jiàn)表2。

表2 15種抗生素藥物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限Table 2 Regress linear formulation，relative coefficient，detection limit of 15 drugs

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取樣品9份，每份5 mL，按20、10、2 ng/mL濃度添加對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度3份供試品溶液，照“1.3”項(xiàng)下方法制備樣品并進(jìn)行測(cè)定。15種藥物回收率在71.8%～87.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.2%～7.9%（n=9）之間，滿足試驗(yàn)要求。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用本法將收集到的4批人參蜂王漿口服液進(jìn)行測(cè)定，均未檢出上述15種藥物。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定人參蜂王漿口服液中四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、林可胺類共15種抗生素藥物的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)到0.02 ng/mL～0.9 ng/mL，可滿足目前國(guó)內(nèi)外動(dòng)物源性食品中相應(yīng)藥物殘留檢測(cè)的要求。采用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)待測(cè)藥物進(jìn)行定性定量，通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及定性離子對(duì)豐度比的比較進(jìn)行確證，避免了檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性的出現(xiàn)。由此可見(jiàn)，本方法適用于人參蜂王漿口服液中藥物殘留的定性定量測(cè)定。

[1]高玉蘭.人參蜂王漿口服液處方依據(jù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].黑龍江醫(yī)藥,2009,22(3):357

[2]朱麗云,楊君,葉憬,等.蜂蜜中的四環(huán)素族抗生素兩種常用檢測(cè)方法的比較[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2010,31(6):132-135

[3]連會(huì),彭奇均.紫外分光光度法測(cè)定蜂蜜中四環(huán)素和羥甲基糠醛[J].理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè),2008,44(6):570-571

[4]薄海波,柳春輝,張紅麗,等.柱切換直接進(jìn)樣高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中3種抗生素的殘留量[J].分析化學(xué),2005.33(4):515-518

[5]趙明,曾明華,余林生,等.高效液相色譜法檢測(cè)蜂蜜中林可霉素殘留的方法研究[J].蜜蜂雜志,2008,28(5):5-7

[6]侯建波,謝文,陳笑梅,等.固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中多類藥物殘留[J].色譜,2011,29(6):535-542

[7]何強(qiáng),孔祥虹,李建華,等.超高效液相一串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中15種喹諾酮類藥物殘留[J].分析試驗(yàn)室,2010,29(3):101-105

[8]徐錦忠,吳宗賢,楊雯筌,等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蜂蜜中8種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留[J].分析化學(xué),2007,35(2):166-170