王岱杰，周曉晶，李強(qiáng)，耿巖玲，于金倩，陳靜嫻，王曉，Dan Staerk

(1.山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014； 2.北京理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制*

王岱杰1，周曉晶2，李強(qiáng)1，耿巖玲1，于金倩1，陳靜嫻1，王曉1，Dan Staerk1

(1.山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014； 2.北京理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

采用硅膠柱色譜和重結(jié)晶的方法制備姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用UV，IR，MS和NMR等方法對(duì)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)。采用國(guó)內(nèi)8家具有分析資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值，并對(duì)定值結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為99.78%，置信度95%的擴(kuò)展不確定度(k=2)為0.13%。該姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于有關(guān)姜黃素檢測(cè)方法的校正和相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

姜黃素；標(biāo)準(zhǔn)樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值；不確定度

Krywoedscurcumin; certified reference material; homogeneity; stability; certification; uncertainty

姜黃是我國(guó)常用大宗藥材，為姜科植物姜黃(Curcuma longa L.)的干燥根莖，在我國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)廣泛分布，具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效，用于胸脅刺痛、胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、癥瘕、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等病癥［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板凝集、抗腫瘤、抗菌、保肝、降糖降血脂等作用［2-7］。姜黃作為藥食同源藥材，市場(chǎng)前景廣闊，2006年姜黃被WHO制定的《藥用植物WHO手冊(cè)》收錄；同時(shí)歐盟、美國(guó)、加拿大等國(guó)家地區(qū)均將姜黃及其相關(guān)提取物列為食品添加劑進(jìn)行管理，日本把姜黃、姜黃提取物作為保健食品使用。姜黃素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)為橙黃色粉末，是我國(guó)藥典規(guī)定的姜黃藥材的高效液相色譜檢測(cè)指標(biāo)。姜黃素在食品生產(chǎn)中廣泛用于腸類制品、罐頭、醬鹵制品等產(chǎn)品的著色，因此需要嚴(yán)格控制姜黃素的質(zhì)量以保證食品的安全性。

目前我國(guó)尚無姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。為了滿足姜黃藥材、成藥分析檢測(cè)及質(zhì)量控制工作的需求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，急需制備姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。為此筆者采用硅膠柱色譜和重結(jié)晶的方法研制了姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。

圖1 姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-3型，瑞士BUCHI公司；高效液相色譜儀：1260型，美國(guó)Agilent公司；液質(zhì)聯(lián)用儀：6520 Q-ToF型，美國(guó)Agilent公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV-2550型，日本島津公司；

核磁共振波譜儀：INOVA 600型，美國(guó)Varian公司；

全自動(dòng)元素分析儀：Vario ELⅢ型，德國(guó)ELEMENTAR公司；

數(shù)字熔點(diǎn)儀：WRS-1B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥儀：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

薄層硅膠板GF254：青島海洋化工廠；

硅膠：G 75～150 μm (100～200目)，青島海洋化工廠；

硅膠：G 49～75 μm (200～300目)，青島海洋化工廠；

氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮：分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；

姜黃藥材：購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為姜科植物姜黃(Curcuma longa L.)的正品藥材。

1.2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

將姜黃藥材粉碎，置于圓底燒瓶中，用石油醚回流提取3次，每次3 h，濾過。濾渣用丙酮回流提取3次，每次3 h，濾過，得丙酮提取物，即姜黃素類總成分。將提取物反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿／甲醇梯度洗脫，薄層色譜跟蹤監(jiān)測(cè)，收集含姜黃素組分。將收集到含姜黃素較純部分放置在通風(fēng)櫥內(nèi)，以乙酸乙酯重結(jié)晶，過濾并干燥。

1.3 純度分析方法

采用等度HPLC、梯度HPLC、薄層色譜、HPLC-MS等多種方法對(duì)所制備的姜黃素樣品進(jìn)行純度檢驗(yàn)。

1.3.1 等度HPLC分析條件

色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%甲酸水溶液(體積比48∶52)，流速為1.0 mL／min；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm。

1.3.2 梯度HPLC分析條件

色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5%甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～20 min，48%A，20～40 min，48%A～100%A，40～50 min，100%A，流速為1.0 mL／min；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：50 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm。

1.3.3 薄層色譜條件

硅膠板：GF254；梯度點(diǎn)樣(20，40，60，80，100 μg)；展開系統(tǒng)：正己烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)、氯仿-甲醇-甲酸(體積比10∶1∶1)；檢測(cè)方法：熒光檢測(cè)、日光檢測(cè)。

1.3.4 MS分析條件

ESI電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；載氣：普氮，流速為10 L／min，溫度為300℃；掃描范圍(m／z)：100～1 000。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV，IR，MS，NMR等方法對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 純度分析

分別采用等度和梯度HPLC對(duì)姜黃素樣品進(jìn)行洗脫，用DAD檢測(cè)器進(jìn)行3D掃描，扣除溶劑峰，掃描色譜圖未見明顯雜質(zhì)色譜峰。430 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，對(duì)姜黃素樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一化定量，扣除溶劑峰，等度和梯度HPLC所得姜黃素樣品純度分別為99.89%和99.85%。從薄層色譜圖看，正己烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)和氯仿-甲醇-甲酸(體積比10∶1∶1)展開體系的Rf值分別為0.85和0.64，熒光檢測(cè)和日光檢測(cè)未見明顯雜質(zhì)。通過考察姜黃素正離子模式和負(fù)離子模式的總離子流圖，未見明顯雜質(zhì)峰。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV，IR，MS和NMR等方法對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，數(shù)據(jù)如下。：264.2，429.2 nm；：3 392 (ν)，1628OH(νC=O)，1 601 (νC=C)，1 428 (δCH)，1 282 (νCO)；ESI-MS：m／z 369.1337［ M+H］+，391.1150［ M+Na］+，759.2406［2M+Na］+，306.1885［ M-H］-。1H和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1，表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12-14］比較，確定制得的樣品為姜黃素。

表1 姜黃素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)(氘代溶劑DMSO-d6)

表2 姜黃素的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(氘代溶劑DMSO-d6)

2.3 均勻性檢驗(yàn)

按 照“GB／T 15000.3-2008／ISO Guide 35：2006標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法(7均勻性研究)”要求，采用隨機(jī)順序重復(fù)測(cè)量的方法，從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取10瓶樣品，按3種次序(第1組：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2組：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3組：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9)進(jìn)行測(cè)定。分別從每瓶中稱取0.2 mg樣品3份，每份樣品分別用1.0 mL甲醇(色譜純）溶解，按1.4等度HPLC分析，以面積百分比讀取樣品的純度值。檢測(cè)數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析。以F檢驗(yàn)，確定姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否附合正態(tài)分布。檢驗(yàn)結(jié)果見表3～表5。

表3 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表4 每瓶測(cè)定結(jié)果的平均值、方差

表5 均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果

瓶間方差用下式計(jì)算：

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差：

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可由MSwithin計(jì)算：

均勻性引入的不確定度：

由表5可知，υ1=9，υ2=20，查F臨界值表得，F(xiàn)0.05(9，20)=2.94，F(xiàn)=MS間／MS內(nèi)=1.52，F(xiàn)＜ F0.05(9，20)，因此研制的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)本樣品是均勻的。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將姜黃素樣品于2～8℃保存，以2年為期，對(duì)制備的姜黃素樣品每6個(gè)月取樣檢驗(yàn)，按1.4等度HPLC分析，以面積百分比讀取樣品的純度值，每份試樣以測(cè)定5次的平均值為其定值結(jié)果，用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［8］，穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察斜率值是否有顯著變化，以此對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性變化進(jìn)行預(yù)測(cè)。

斜率按下式計(jì)算：

直線上點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由下式計(jì)算：

與斜率相關(guān)的不確定度用下式計(jì)算：

自由度為n-2和95%置信水平的分布t因子為3.182，即：

由于：

因此斜率的變化不顯著，即姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品在2年內(nèi)未觀測(cè)到明顯的不穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性引入的不確定度：

2.5 定值

按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，參加實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目為8個(gè)［8-11］。隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，每瓶平行測(cè)定2次。定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，用高效液相色譜儀測(cè)定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值。對(duì)所采集的測(cè)定結(jié)果，采用格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)異常值，測(cè)定結(jié)果呈正態(tài)分布。依據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得全部測(cè)定結(jié)果，計(jì)算出姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值。定值結(jié)果見表7。

表7 姜黃素純度定值結(jié)果及不確定度 %

根據(jù)表7數(shù)據(jù)計(jì)算測(cè)定測(cè)定結(jié)果的總平均值：

實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差：

多家定值引入的不確定度：

u定=sX=0.05%=5.00×10-4

研制的標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度由以下幾部分組成：

(1)均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度；

(2)穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度；

(3)多家定值引入的不確定度。

各不確定度分量互不相關(guān)，因此合成不確定度：

代入數(shù)據(jù)計(jì)算得： u=0.065%

在置信概率為95%時(shí)，k=2，則擴(kuò)展不確定度U=2u=0.065%×2=0.13%。

3 結(jié)論

(1)針對(duì)我國(guó)缺少姜黃素國(guó)家實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的現(xiàn)狀，對(duì)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行研制，建立了姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法。根據(jù)GB／T 15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，對(duì)制得姜黃素樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性及定值研究。

(2)制備出標(biāo)準(zhǔn)值為99.78%，擴(kuò)展不確定度(95%置信區(qū)間)為0.13%的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品，該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)規(guī)范要求，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域的研究空白。該標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制可滿足姜黃及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測(cè)、質(zhì)量控制工作的需求，為其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性提供技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版一部)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010: 247-248.

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［9］GB／T 15000.1-1994 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(1) 在技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中陳述標(biāo)準(zhǔn)樣品的一般規(guī)定(等效采用ISO Guide 6 《在國(guó)際陳述標(biāo)準(zhǔn)樣品的一般規(guī)定》)［S］.

［10］GB／T 15000.2-1994 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(2) 標(biāo)準(zhǔn)樣品常用術(shù)語和定義(等效采用ISO Guide 30 《標(biāo)準(zhǔn)樣品常用術(shù)語和定義》)［S］.

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Preparation of Certified Referrence Materials of Curcumin

Wang Daijie1， Zhou Xiaojing2， Li Qiang1， Geng Yanling1， Yu Jinqian1， Chen Jingxian1， Wang Xiao1， Dan Staerk1
(1. Shandong Academy of Sciences， Shandong Analysis and Test Center， Jinan 250014, China; 2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China)

Curcumin certified reference material was separated by silica gel column chromatography and recrystallization method. Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR. The homogeneity and stability were systematic checked. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The results showed that the certified value of the reference material of curcumin was 99.78% with the expanded uncertainty of 0.13% (k=2) in confidence coefficient of 95%. The reference material of curcumin can conform to the technical requirement of the certified reference material. The materials can be used for method validation and quality control of regarding products.

O656

A

1008-6145(2014)04-0001-05

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.04.001

*國(guó)家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310243)；山東省海外高層次人才資助專項(xiàng)資金項(xiàng)目；北京市科學(xué)技術(shù)研究院市級(jí)財(cái)政項(xiàng)目(PXM2013_178305_000009)

聯(lián)系人：王岱杰；E-mail: wangdaijie@126.com

2014-04-22