沈小輝，楊菲，李功波，梁曉翠，謝龍宇，陳筱詩(shī)，唐文娟

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院第三臨床醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；4.十堰市婦幼保健院，湖北十堰442000）

·論著·

1α,25-二羥維生素D3對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化和OPG mRNA/RANKL mRNA表達(dá)的影響

沈小輝1，楊菲1，李功波2，梁曉翠2，謝龍宇3，陳筱詩(shī)3，唐文娟4

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院第三臨床醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；4.十堰市婦幼保健院，湖北十堰442000）

目的研究1α,25-二羥維生素D3[1α,25-(OH)2D3]對(duì)體外培育SD大鼠成骨細(xì)胞(OB)增殖、分化和細(xì)胞核因子κ配體(RANKL)及骨保素(OPG)mRNA表達(dá)的影響。方法采用胰蛋白酶和膠原酶消化法從24 h新生SD乳鼠顱蓋骨分離得到的OB，經(jīng)1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的1α,25-(OH)2D3干預(yù)24 h、48 h和72 h后，MTT比色法檢測(cè)OB增殖率；PNPP法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性；應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中OPG和RANKL的mRNA表達(dá)。結(jié)果1 nmol/L組成骨細(xì)胞A值在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別為(0.335±0.080)、(0.451±0.086)、(0.545±0.085)；100 nmol/L組OB ALP活性分別增加至(6.274±1.561)U/g、(5.021±1.703)U/g、(6.854±1.468)U/g；OPG mRNA表達(dá)分別降低至(0.365±0.068)、(0.340±0.046)、(0.381±0.051)；RANKL mRNA表達(dá)分別增加至(0.622± 0.089)、(0.550±0.064)、(0.468±0.062)；與0 nmol/L組比較，RANKL/OPG比值分別增加138.53%、153.45%、157.71%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論高濃度1α,25-(OH)2D3可抑制OB增值和OPG mRNA表達(dá)，促進(jìn)其分化和礦化，上調(diào)RANKL/OPG的基因表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，增強(qiáng)骨更新。

1α,25-二羥維生素D3；成骨細(xì)胞；增殖分化；細(xì)胞核因子κ配體；骨保素

成骨細(xì)胞(OB)是1α,25-(OH)2D3的重要靶器官，可合成和分泌組成骨基質(zhì)的膠原和糖蛋白，是骨形成的主要細(xì)胞。1α,25-(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的最終活性成分，研究表明1α,25-(OH)2D3可調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝平衡，抑制OB增殖，在OB分化晚期可促進(jìn)ALP mRNA的表達(dá)，刺激骨吸收調(diào)控骨重建[1-2]。通過(guò)對(duì)-1α羥化酶基因敲除小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，1α, 25-(OH)2D3缺乏導(dǎo)致相關(guān)激素功能紊亂和骨質(zhì)疏松癥等，骨保素(Osteoprotegerin，OPG)基因敲除小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，核因子κ-B受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor κ-B ligand，RANKL)基因敲除小鼠表現(xiàn)出典型的大理石樣骨病和出牙障礙，但作用機(jī)制尚未闡明。OPG-RANKL-RANK是OB和破骨細(xì)胞(OC)相互作用的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，1α,25-(OH)2D3促進(jìn)骨吸收很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL和OPG mRNA表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)OC介導(dǎo)的骨吸收[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究1α,25-(OH)2D3對(duì)體外誘導(dǎo)培育的OB增殖分化能力、OPG及RANKL mRNA表達(dá)的影響，從分子水平上探討其參與骨代謝的調(diào)控和對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用，為維生素D治療骨代謝性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、HEPES、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、1α,25-(OH)2D3(美國(guó)Sigma)；青、鏈霉素(Hyclone公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)；骨鈣素試劑盒(天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司)；RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和Trizol總RNA提取試劑盒(MBI公司產(chǎn)品)；RT-PCR試劑盒與RNA提取試劑盒(Takara公司)。

1.2 儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Precision Scientific公司)；分光光度計(jì)(U2200，HITACH，日本)；電泳儀(Bio-Rad Power-PAC200，美國(guó))；PCR熱循環(huán)儀(Hybaid，America)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)通用生物系統(tǒng)公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津UV-1601)；凝膠成像分析儀(UVP-97-0129-02，美國(guó))。

1.3 新生大鼠顱骨OB的培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下，取出生24 h內(nèi)新生SD乳鼠(雌雄不限，清潔級(jí)，由湖北醫(yī)藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)的顱骨,參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]介紹的分段膠原酶消化法進(jìn)行OB的分離。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打傳代。細(xì)胞傳至第3～4代后通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色鑒定所用細(xì)胞為OB。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成4×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(150 μl/孔)，接種于24孔培養(yǎng)板(500 μl/孔)，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察待細(xì)胞80%融合時(shí)將含血清培養(yǎng)基吸棄，平衡鹽溶液沖洗兩次，加入含不同濃度1α,25-(OH)2D3的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，不同時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞的增殖、分化和OPG mRNA/RANKL mRNA表達(dá)。

1.4 藥物干預(yù)1α,25-(OH)2D3溶于無(wú)水乙醇配成100 μmol/L貯存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L，分別作為低、中、高濃度組，設(shè)置為1α,25-(OH)2D3干預(yù)組，另設(shè)空白對(duì)照組(培養(yǎng)液中含無(wú)水乙醇10 μl)，分別干預(yù)處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞增殖功能測(cè)定接種于96孔培養(yǎng)板各組經(jīng)干預(yù)處理后吸去培養(yǎng)基，換上無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入MTT 20 μl，使其終濃度為500 mg/L，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，離心吸棄上清，每孔加入10 μl二甲基亞砜振蕩溶解沉淀，10 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔492 nm吸光度值(A)。

1.6 堿性磷酸酶活性測(cè)接種于24孔培養(yǎng)板各組經(jīng)干預(yù)處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次，給每孔加入250 μl 0.1%TritonX-100、4℃反復(fù)凍融破碎細(xì)胞,離心后收集上清液，按堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明，采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法(PNPP法)測(cè)定ALP活性，Bradford法測(cè)定細(xì)胞液蛋白濃度，堿性磷酸酶活性用蛋白濃度校正，結(jié)果以每克蛋白中堿性磷酸酶國(guó)際單位(U/g protein)表示。以堿性磷酸酶活性表示細(xì)胞分化程度。

1.7 RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG/RANKL mRNA表達(dá)(1)細(xì)胞內(nèi)總RNA的提?。河?℃PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞系總RNA，并測(cè)定濃度。(2)總RNA的鑒定和定量：取5 μl RNA溶液，應(yīng)用RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的純度和完整性。(3)RT-PCR引物序列及反應(yīng)條件為：①根據(jù)Genebank并參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)RANKL、OPG和β-actin三對(duì)基因的引物(見(jiàn)表1)，由上海生工生物工程公司合成。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：每管總RNA 1 μg，10×RT-PCR緩沖液5 μl，25 mmol/L MgCl210 μl，10 mmol/L dNTP 5 μl，4×107U/L RNA酶抑制劑、5×106U/L Taq DNA聚合酶、5×106U/L逆轉(zhuǎn)錄酶、上下游引物(20 mmol/L)各1 μl，無(wú)菌DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體積至50 μl。50℃30 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，94℃變性2 min。③PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增條件為：94℃變性45 s，60℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸反應(yīng)增加10 min。β-actin循環(huán)數(shù)為25，其余參數(shù)同上。④擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA條帶的單位面積光密度用凝膠成像儀測(cè)定，計(jì)算各測(cè)試基因與內(nèi)參基因光密度比值，半定量其mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較用單因素方差分析(One-wayANOVA)，各組間兩兩比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1α,25-二羥維生素D3對(duì)OB增殖的影響與24 h比較(詳見(jiàn)表2)，0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L組在干預(yù)OB 72 h后，A值分別增加至(0.461±0.120)、(0.545±0.085)、(0.487±0.077)、(0.372± 0.064)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與0 nmol/L組比較，1 nmol/L組OB的A值在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別增加20.50%、38.77%、18.22%，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；100 nmol/L組OB A值在干預(yù)48 h后增加19.69%，72 h后減少19.30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；提示在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，OB的增殖與1α,25-(OH)2D3的濃度和干預(yù)時(shí)間相關(guān)。

2.2 1α,25-二羥維生素D3對(duì)OB分化的影響與24 h比較(詳見(jiàn)表3)，0 nmol/L和1 nmol/L組在干預(yù)OB 48 h后，ALP分別增加40.86%和36.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；72 h后ALP分別增加至(5.739±1.156)U/g和(5.359±1.691)U/g，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與0 nmol/L組比較，100 nmol/L組OB ALP活性在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別增加至(6.274±1.561)U/g、(5.021±1.703)U/g、(6.854±1.468)U/g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且24 h內(nèi)ALP活性與1α,25-(OH)2D3濃度呈正相關(guān)(r=0.852)。

2.3 1α,25-二羥維生素D3對(duì)OPG mRNA表達(dá)的影響與0 nmol/L組比較(詳見(jiàn)表4)，100 nmol/L組OB內(nèi)OPG mRNA表達(dá)在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別降低至(0.365±0.068)、(0.340±0.046)、(0.381± 0.051)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；10 nmol/L組OB內(nèi)OPG mRNA表達(dá)在干預(yù)48 h和72 h后，分別降低29.97%和25.56%，0 nmol/L組干預(yù)48 h降低14.73%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；72 h內(nèi)OPG mRNA表達(dá)與1 α,25-(OH)2D3濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.754)；與24 h比較，0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L組在干預(yù)OB 72 h后，OPG mRNA表達(dá)分別增加27.53%、30.94%、4.69%、4.38%，除0 nmol/L和1 nmol/L之外，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示1α,25-(OH)2D3可抑制OB OPG mRNA表達(dá)。

2.4 1α,25-二羥維生素D3對(duì)RANKL mRNA表達(dá)的影響與0 nmol/L組比較，100 nmol/L組OB內(nèi)RANKL mRNA表達(dá)在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別增加至(0.622±0.089)、(0.550±0.064)、(0.468±0.062)，10 nmol/L組分別增加58.50%、47.45%和53.44%，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(詳見(jiàn)表5)；72 h內(nèi)RANKL mRNA表達(dá)與1α,25-(OH)2D3濃度呈正相關(guān)(r=0.729)；與24 h比較，1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L組在干預(yù)OB 72 h后，RANKL mRNA表達(dá)分別增加32.03%、42.26%、50.49%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示1α,25-(OH)2D3可上調(diào)OB RANKLmRNA表達(dá)。

表5 1α,25-(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)的影響

表5 1α,25-(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)的影響

注：同一時(shí)間點(diǎn)，各組與0 nmol/L組比較，aP＜0.05；同一濃度組內(nèi)，72 h、48 h與24 h比較，bP＜0.05。

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2.5 1α,25-二羥維生素D3對(duì)RANKL/OPG比值表達(dá)的影響與0 nmol/L組比較，100 nmol/L組RANKL/OPG比值在干預(yù)24 h、48 h、72 h后，分別增加138.52%、153.45%、157.71%，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(詳見(jiàn)表6)；72 h內(nèi)RANKL/OPG比值與1α,25-(OH)2D3濃度呈正相關(guān)(r=0.928)；與24 h比較，0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L組在干預(yù)OB 72 h后，RANKL/OPG比值表達(dá)分別降低至(0.480±0.113)、(0.624±0.093)、(0.863±0.107)、(1.237± 0.258)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，RANKL/OPG比值與培養(yǎng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.740)，提示1α, 25-(OH)2D3可增高OB內(nèi)RANKL/OPG比例。

表6 1α,25-(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞RANKL/OPG比值的影響

表6 1α,25-(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞RANKL/OPG比值的影響

注：同一時(shí)間點(diǎn)，各組與0 nmol/L組比較，aP＜0.05；同一濃度組內(nèi)，72 h、48 h與24 h比較，bP＜0.05。

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3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，骨皮質(zhì)多孔、變薄為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡紊亂有關(guān)[8]。骨形成和吸收主要由OB和OC來(lái)完成，OB和OC參與骨代謝并共同維持骨代謝平衡。OB來(lái)源于骨髓間質(zhì)細(xì)胞，是骨形成過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，對(duì)骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)、骨代謝平衡和骨量維持起關(guān)鍵作用[9]。新生SD大鼠顱骨來(lái)源培養(yǎng)出的OB，具有良好的增殖與成骨活性，能連續(xù)傳代增殖，純度高，細(xì)胞生物學(xué)特征穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)以O(shè)B進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松新藥篩選和藥效學(xué)評(píng)價(jià)的細(xì)胞模型。

體外培養(yǎng)的OB表型發(fā)展經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分泌與成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和細(xì)胞休止與凋亡四個(gè)階段，細(xì)胞增殖是OB成骨作用的最初階段[10-11]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 nmol/L組OB吸光度A值在干預(yù)后，與0 nmol/L組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，100 nmol/L組OB在干預(yù)72 h后，A值減少(0.089±0.013)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但1 nmol/L組OB吸光度A值在干預(yù)后均增加，與0 nmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且72 h內(nèi)OB增殖與時(shí)間呈正相關(guān)，說(shuō)明低濃度1α,25-(OH)2D3在體外可增強(qiáng)OB活性，高濃度1α,25-(OH)2D3可抑制OB增殖能力，同時(shí)OB的增殖情況可能與周?chē)h(huán)境中1α,25-(OH)2D3的水平和干預(yù)時(shí)間有關(guān)，提示1α,25-(OH)2D3對(duì)骨代謝呈雙相作用，低濃度1α,25-(OH)2D3刺激OB的增殖，增加OB的數(shù)量和功能，可促進(jìn)骨形成；高濃度1α,25-(OH)2D3可抑制OB的增殖，刺激骨吸收。正常的骨代謝是骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)骨吸收低于骨形成時(shí)可以導(dǎo)致骨硬化，當(dāng)骨吸收大于骨形成時(shí)則導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[12-13]。

ALP是骨發(fā)生與形成的關(guān)鍵酶類，是最常見(jiàn)評(píng)價(jià)骨形成能力的指標(biāo)，也是識(shí)別和評(píng)價(jià)OB分化成熟程度和活性狀態(tài)的早期標(biāo)志，其表達(dá)標(biāo)志骨形成的狀況，表明細(xì)胞分化的開(kāi)始[14]。OB增殖期OB數(shù)量增加并形成多層細(xì)胞，ALP mRNA在OB增殖早期就開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，ALP分泌表達(dá)，且ALP活性升高，增殖后期ALP的表達(dá)緊接著OB增殖表達(dá)的下調(diào)，ALP活性可增加2～3倍，標(biāo)志細(xì)胞分化的開(kāi)始，在基質(zhì)成熟期達(dá)到峰值[15]。本研究結(jié)果顯示，與0 nmol/L組比較，1 nmol/L組OB的ALP活性在干預(yù)24 h、48 h、72 h后均降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但100 nmol/L組OB的ALP活性在干預(yù)24 h、48 h、72 h后均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h內(nèi)ALP活性隨著1α,25-(OH)2D3濃度增加呈正相關(guān)(r=0.535)。研究發(fā)現(xiàn)OB增殖與分化呈負(fù)相關(guān)，OB分裂、增殖速度減慢常是細(xì)胞分化的結(jié)果[16-17]，與本研究報(bào)道的結(jié)果一致。研究結(jié)果提示在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)高濃度組1α,25-(OH)2D3可增強(qiáng)OB內(nèi)ALP高表達(dá)，能促進(jìn)OB分化，ALP的表達(dá)隨著增殖速度減慢而增強(qiáng)，ALP活性的影響依賴于1α,25-(OH)2D3的干預(yù)濃度和細(xì)胞所處的階段[2]；低濃度1α,25-(OH)2D3可抑制OB的早期分化，利于OB的增殖。ALP可催化分解有機(jī)磷酸釋放無(wú)機(jī)磷，增加局部無(wú)機(jī)磷酸的濃度，促使基質(zhì)礦化，礦化是細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟的功能表現(xiàn)，為骨形成和骨轉(zhuǎn)換的敏感標(biāo)志[18]。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的OC分化過(guò)程中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，是OB作用于OC的重要途徑，在正常免疫狀態(tài)下，OC的分化和活化主要依賴于OB，OB和OC的動(dòng)態(tài)平衡受多種因素的精細(xì)調(diào)控，維持著正常骨代謝[19-20]。正常骨轉(zhuǎn)化和骨量的穩(wěn)定主要取決于OPG和RANKL的平衡。OB分泌的OPG和RANKL對(duì)OC的分化、成熟和信號(hào)傳遞起著重要的調(diào)節(jié)作用[21]。RANKL能直接啟動(dòng)OC前體細(xì)胞或OC細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，促進(jìn)OC分化，增強(qiáng)成熟OC的活力，抑制OC凋亡。RANKL的受體RANK可上調(diào)OC靶基因表達(dá)，促進(jìn)OC增殖、分化、延長(zhǎng)其生命。以吸收活性區(qū)域的OC表達(dá)程度最高RANKL和RANK調(diào)節(jié)骨重建，促進(jìn)OC分化活化[22-23]。OPG是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，屬于可溶性分泌型糖蛋白，是一種誘餌性受體，通過(guò)與配體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)阻斷RANKL與RANK結(jié)合，進(jìn)而抑制OC前體細(xì)胞的分化，抑制成熟OC的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡[24]。因此，RANKL/OPG、OPG和RANKL的表達(dá)比值決定了骨量吸收的多少及OC分化、成熟和功能。本研究結(jié)果顯示：100 nmol/L組OPG mRNA的表達(dá)明顯少于0 nmol/L組，而RANKL mRNA表達(dá)明顯高于0 nmol/L組，并呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明1α,25-(OH)2D3干預(yù)后，OPG表達(dá)增強(qiáng)，RANKL表達(dá)減少，RANKL/OPG比值明顯升高，提示破骨作用大于成骨作用；而1 nmol/L組OPG和RANKL mRNA表達(dá)與0 nmol/L組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明低濃度組1α,25-(OH)2D3可能抑制OB表達(dá)分泌RANKL，而增加OPG的表達(dá)，提示成骨作用大于破骨作用，1α,25-(OH)2D3可能通過(guò)RANKL/RANK/OPG調(diào)控軸來(lái)抑制OC的骨吸收，最終抑制了OC生成和活化，從而達(dá)到促進(jìn)骨形成和增加骨密度，起到保護(hù)骨的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀察了1α,25-(OH)2D3對(duì)OB代謝調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)其治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制與其促進(jìn)OB的增殖、分化，增加OB中OPG的表達(dá)來(lái)抑制OC的分化和成熟的作用有關(guān)，為1α,25-(OH)2D3臨床治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Impact of 1 alpha,25-dihydroxy vitamin D3on osteoblastic proliferation and differentiation and the expression of OPG mRNA/RNAKL mRNA.

SHEN Xiao-hui1,YANG Fei1,LI Gong-bo2,LIANG Xiao-cui2,XIE Long-yu3, CHEN Xiao-shi3,TANG Wen-juan4.1.Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine;2.Shiyan Maternal and Child Health Hospital;3.the Third Clinical Medical College,Hubei University of Medicine;4.the First Clinical Medical College,Hubei University of Medicine;5.Taihe Hospital affiliated to Hubei University of Medicine;Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo research the influence of 1α,25-(OH)2D3on osteoblastic proliferation,differentiation,the expression of Nuclear factor kappa ligand and osteoprotegerin mRNA in vitro cultured osteoblasts of SD rats (OB).MethodsThe OB were isolated from neonatal SD rat calvaria in 24 h by trypsin and collagenase digestion method.Set up 0 nmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L,100 nmol/L,1α,25-(OH)2D3as blank control,low,middle and high intervention group.Use MTT assay to detect the proliferation rate of OB.PNPP method was used to determine the activity of alkaline phosphatase(ALP).The RT-PCR method was applied to detect the expression of OPG mRNA/RNAKL mRNA after intervening for 24 h,48 h and 72 h.ResultsThe A value of osteoblasts of the 1 nmol/L group was (0.335±0.080),(0.451±0.086),(0.545±0.085)after the intervention of 24 h,48 h,72 h;the ALP activity of osteoblasts of the 100 nmol/L group were increased to(6.274±1.561),(5.021±1.703),(6.854±1.468)respectively;the mRNA expression of osteoblastic proliferation(OPG)were respectively decreased to(0.365±0.068),(0.340±0.046),(0.381± 0.051);while the mRNA expression of RANKL were increased to(0.622±0.089),(0.550±0.064),(0.468±0.062);the ratio of RANKL and OPG increased by 138.53%,153.45%,157.71%respectively,compared with 0 nmol/L group,the statistical differences were significant(P＜0.05).ConclusionHigh concentration of 1α,25-(OH)2D3can inhibit OB proliferation and the OPG mRNA expression,promote the differentiation and mineralization of OB,enhance the gene expression of the ratio of RANKL and OPG-thus promoting osteoclast-mediated bone resorption and enhancing bone update.

1α,25-(OH)2D3;Osteoblast;Proliferation and differentiation;Nuclear factor kappa ligand;Osteoprotegerin

R329.2+8

A

1003—6350(2014)01—0005—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0002

2013-07-20)

湖北科技廳資助課題(編號(hào)：鄂科技2011CDB01804)

唐文娟。E-mail：metangwenj@163.com