茅新華 何 軍 彭 衛(wèi)

(1.中國石油工程建設(shè)公司拉克分公司，北京 100120；2.中國石油烏魯木齊石化分公司，新疆 烏魯木齊 830019)

0 前言

利用微生物處理石油廢水是一項(xiàng)具有廣闊前景的高新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)從石化煉油廠曝氣池廢水中分離篩選出以石油為唯一碳源的降解菌，初步鑒定了菌株的特性，并研究了影響其降解石油能力的因素，為煉油廠廢水處理等應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 概述

1.1 目前研究概況

據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠降解石油的微生物有200多種，其中細(xì)菌有假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、棒桿菌屬(Corynebacterium sp.)、微球菌屬(Micrococcus sp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)等[1]。已經(jīng)分離篩選出能降解原油的菌種有：Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas，Alicaligenes，Rhodococcus erythropolis，Acinetobacter，Devouroil等，能夠降解芳香烴的菌有：Aeromona，Alicaligenes，Bacillus，Corynebacteria，F(xiàn)lavobacterium，Micrococcus，Mycobacterium，Nocardia，Pseudomonas，Rhodococcus等[2,3]。但這些研究工作，大多以分離鑒定石油烴及其相應(yīng)化合物的微生物類型和分布出發(fā)，以及微生物降解土壤和海洋中原油的能力方面[4-6]，缺乏利用篩選的微生物來處理煉油工業(yè)廢水等實(shí)際應(yīng)用方面的進(jìn)一步研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

采集曝氣池廢水→預(yù)處理、制備稀釋樣品→原油培養(yǎng)基涂布(32℃，培養(yǎng)7-10天)→分離、純化(純化培養(yǎng)基)→細(xì)菌形態(tài)鑒定(形態(tài)、革蘭氏染色)→初步降解效果實(shí)驗(yàn)(研究培養(yǎng)時(shí)間、pH、接種量、菌齡對(duì)降解率的影響)→菌種保藏 (試管斜面、4℃冰箱)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種篩選

取曝氣池廢水1mL，加入滅菌的(121oC、高壓蒸汽滅菌15-20min)100mL原油液體培養(yǎng)基中，32oC，轉(zhuǎn)速120r/min搖床培養(yǎng)96h。待培養(yǎng)液混濁后，吸取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入滅菌的100mL的原油液體培養(yǎng)基中，32oC繼續(xù)搖床培養(yǎng)96h。取1mL該富集液，按10-1、10-2、10-3的梯度稀釋后。分別取0.1mL涂布于原油固體培養(yǎng)基平板上。于32oC培養(yǎng)7天后，在生長狀況良好的平板上挑選長勢最好的單菌落，在純化培養(yǎng)基平板上分離、純化，反復(fù)分離純化直到獲得單一菌株為止，即獲得以石油為唯一碳源的菌株。

2.2 菌種特征

在純化培養(yǎng)基平板上分離、純化，獲得了兩種不同的菌株，革蘭氏染色均為陰性。分別標(biāo)記為T-1，T-2。石油降解菌的特征，如表1所示。

表1 石油降解菌的特征

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解率的影響

取6個(gè)250mL的三角瓶，分別裝入100mLpH為7.0的原油液體培養(yǎng)基，121oC，高壓蒸汽滅菌15min,自然冷卻至室溫。將活化24h的菌株配制成菌懸液，向其中的5個(gè)三角瓶中分別接種1.0mL菌懸液，1瓶不接菌的作為對(duì)照。32oC，轉(zhuǎn)速120r/min搖床培養(yǎng)，在培養(yǎng)12h、24h、48h、72h、96h后分別測定其去油率。

去油率的測定方法：分別向每個(gè)三角瓶中加入60mL氯仿，充分萃取。取2mL有機(jī)層(下層)萃取液，用氯仿稀釋150倍，以氯仿為空白，在250nm處測定其吸光值，然后計(jì)算去油率。

2.4 pH對(duì)降解率的影響

將活化24h的菌株配制成菌懸液，取1.0mL菌懸液分別接種到已滅菌的pH依次為3、5、6、7、8、9的100mL原油液體培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中，不接菌的作為對(duì)照。32oC，轉(zhuǎn)速120r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后分別測定其去油率，方法同2.3。

2.5 接種量對(duì)降解率的影響

將活化24h的菌株配制成菌懸液，分別取0.1mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL菌懸液(1.2×106個(gè)/mL)，依次接種到已滅菌的pH為7.0的100mL原油液體培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中，不接菌的作為對(duì)照。32oC，轉(zhuǎn)速120r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后分別測定其去油率，方法同2.3。

2.6 菌齡對(duì)降解率的影響

將活化12h、24h、48h、72h、96h的菌株配制成菌懸液，各取1.0mL菌懸液分別接種到pH為7.0的100mL原油液體培養(yǎng)基(250mL三角瓶)中，不接菌的作為對(duì)照。32oC，轉(zhuǎn)速120r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后分別測定其去油率，方法同2.3.4。

2.7 菌種保藏

把本實(shí)驗(yàn)所獲得的對(duì)原油有降解能力的菌株進(jìn)行保藏，用純化培養(yǎng)基接試管斜面，在32℃下培養(yǎng)24h后，保藏于4℃冰箱。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種的獲得

將分離純化獲得的兩種菌株，分別進(jìn)行初步石油降解實(shí)驗(yàn)，其中菌株T-1的降解率較高，故以T-1作為本實(shí)驗(yàn)所用的菌株。

3.2 菌株降解率的測定

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解率的影響

圖2 pH對(duì)降解率的影響

由圖1可見，培養(yǎng)時(shí)間的變化，對(duì)去油率也有一定的影響。在12-48h時(shí)間段，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，去油率逐漸增加。在搖床培養(yǎng)期間可以明顯觀察到石油的乳化現(xiàn)象，菌體與油滴形成了大量的絮狀小球，使菌體能充分和石油接觸，從而提高了其降解效率。在48-96h時(shí)間段，去油率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，可能是由于菌種老化，活力降低等因素，導(dǎo)致了去油率的降低。

由圖2可見，原油液體培養(yǎng)基的pH不同，對(duì)去油率也有很大的影響。pH在6-8的范圍內(nèi)，都呈現(xiàn)了較好的降解能力，在pH7.0時(shí)，降解效果最好，去油率為33%，可見pH過高或者過低都不利于對(duì)原油的降解。因此，以下實(shí)驗(yàn)均在pH7.0的條件下進(jìn)行。

圖3 接種量對(duì)降解率的影響

由圖3可見，接種量的變化，對(duì)去油率也產(chǎn)生了較大的影響。隨著接種量的增大，去油率逐漸增加。當(dāng)接種量為2mL(1.2×106個(gè)/mL)時(shí)，去油率達(dá)到了47.4%，可能是菌濃度比較低，降解菌數(shù)量少，去油率低；當(dāng)濃度增大時(shí)，由于降解菌密度大大增加，去油率明顯增大。

由圖4可見，接種菌的菌齡越大，去油率就越低。接種菌的菌齡為12h時(shí)，有最好的降解效果，去油率可達(dá)41.8%。培養(yǎng)時(shí)間過長，由于菌種老化，表面活性降低，對(duì)石油的乳化能力變?nèi)?，從而?dǎo)致了去油率的降低。

圖4 菌齡對(duì)降解率的影響

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

(1) T-1菌株能以石油為唯一碳源生長，并對(duì)原油具有較好的降解效果。

(2) 研究結(jié)果表明：T-1菌株對(duì)原油的降解受培養(yǎng)時(shí)間、pH、接種量、菌齡等因素的影響。培養(yǎng)時(shí)間為48h時(shí)，去油率達(dá)49.2%；pH7.0時(shí)，去油率為33%；接種量為2%(細(xì)菌數(shù)1.2×106個(gè)/mL)時(shí)，去油率為47.4%；菌齡為12h時(shí)，去油率為41.8%。

4.2 討論

4.2.1 存在問題

(1) 從煉油廠曝氣池含油廢水中分離、篩選出以原油為唯一碳源的菌株，并初步研究了其對(duì)石油的降解能力,在實(shí)驗(yàn)室條件下降解率可達(dá)49.2%，若應(yīng)用于煉油廢水處理，還有待于進(jìn)一步的馴化、篩選。

(2) 在研究影響石油降解率因素的實(shí)驗(yàn)中，由于篩選、純化菌株時(shí)溫度均為32oC，所以在測定降解率時(shí)，各組實(shí)驗(yàn)都在32oC下進(jìn)行。因此沒有考慮溫度對(duì)降解率的影響，但有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，溫度對(duì)降解率也有一定的影響。

(3) 含油量的多少對(duì)降解率也有一定的影響[8]，由于時(shí)間有限，本實(shí)驗(yàn)沒有研究不同含油量對(duì)降解率的影響。

4.2.2 展望

目前，利用微生物處理含油廢水面臨重重困難，篩選、馴化能用于處理石化企業(yè)含油廢水的高效降解菌也有一定的難度。但該方法費(fèi)用低、而且不會(huì)造成二次污染。因此，這是一項(xiàng)具有廣闊前景的高新技術(shù)，相信該技術(shù)替代傳統(tǒng)的處理方法不久將會(huì)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

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