朱政斌, 喻鑫玲

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽(yáng) 414006; 2. 湖南省血吸蟲(chóng)病防治所, 湖南 岳陽(yáng) 414000)

日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在東方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差異初探

朱政斌1, 喻鑫玲2

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽(yáng) 414006; 2. 湖南省血吸蟲(chóng)病防治所, 湖南 岳陽(yáng) 414000)

東方田鼠具有天然抗日本血吸蟲(chóng)活性, 為了篩選抗日本血吸蟲(chóng)疫苗分子, 通過(guò)日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染東方田鼠和昆明小鼠, 感染11天后收集東方田鼠和昆明小鼠肝童蟲(chóng). 肝童蟲(chóng)經(jīng)組織勻漿收集蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后SDS-PAGE分離, 切取差異蛋白條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定. 發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要為日本血吸蟲(chóng)結(jié)構(gòu)蛋白, 能量代謝相關(guān)蛋白以及熱休克蛋白等. 為進(jìn)一步研究抗日本血吸蟲(chóng)疫苗奠定了基礎(chǔ).

東方田鼠; 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng); 結(jié)構(gòu)蛋白; 能量代謝相關(guān)蛋白; 熱休克蛋白

血吸蟲(chóng)病是六大重點(diǎn)熱帶病之一, 主要流行于非洲、中東、南美、東亞和東南亞的76個(gè)國(guó)家和地區(qū).全球大約有6億多人受到威脅, 2億多人受感染, 2000多萬(wàn)人有嚴(yán)重臨床癥狀[1]. 日本血吸蟲(chóng)病在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)廣泛存在, 是我國(guó)主要的寄生蟲(chóng)病[2]. 東方田鼠是唯一對(duì)日本血吸蟲(chóng)有抗性的嚙齒類(lèi)哺乳動(dòng)物,是研究日本血吸蟲(chóng)抗病機(jī)制的最佳動(dòng)物模型[3]. 研究發(fā)現(xiàn), 日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染東方田鼠由皮膚進(jìn)入體內(nèi)移行, 經(jīng)過(guò)肺臟至肝臟, 在肝臟中停止發(fā)育并最終在肝臟消亡[4]. 篩選東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)抗性相關(guān)的靶分子, 對(duì)研制抗日本血吸蟲(chóng)疫苗和治療藥物具有重要借鑒意義[5]. 本文通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法, 篩選日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在東方田鼠和昆明小鼠肝臟中的差異蛋白, 進(jìn)一步深入了解東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)后的抗日本血吸蟲(chóng)機(jī)制, 為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)抗日本血吸蟲(chóng)抗原提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

東方田鼠(80～100克)由湖南省血吸蟲(chóng)防治研究所提供, SPF級(jí)昆明小鼠(25～28克)購(gòu)自湖南景達(dá)斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心. 每種動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中均隨機(jī)分組, 雌雄各半. 每組動(dòng)物均感染30只.

1.2 童蟲(chóng)收集和動(dòng)物感染

感染日本血吸蟲(chóng)陽(yáng)性釘螺由湖南省血吸蟲(chóng)病防治所篩選. 在室溫條件下, 用雙蒸水將陽(yáng)性釘螺洗滌干凈, 將其置于三角瓶中, 然后在光照條件下逸尾蚴, 使用腹部貼片法感染, 每只東方田鼠感染1000條尾蚴, 每只昆明小鼠感染50條尾蚴, 感染時(shí)間20min. 感染11天后, 從動(dòng)物肝臟收集童蟲(chóng), 童蟲(chóng)收集方法為將動(dòng)物肝臟組織剪成小塊后在生理鹽水中讓童蟲(chóng)釋放, 在解剖鏡下收集童蟲(chóng).

1.3 童蟲(chóng)蛋白提取與分離

將從東方田鼠和昆明小鼠肝臟中收集的童蟲(chóng)分別進(jìn)行組織勻漿, 組織勻漿在緩沖液中(緩沖液為5 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.05% Nonidet P-40, 0.5 mM Na3EGTA, 0.5 mM Na3EDTA, and protease inhibitors cocktail; Roche公司產(chǎn)品)進(jìn)行, 操作溫度為4℃, 勻漿后進(jìn)行離心, 離心條件為離心力10000g, 溫度為4℃,離心時(shí)間20min, 離心完成后收集上清. 上清液蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量. 蛋白質(zhì)定量后進(jìn)行SDS-PAGE分離, SDS-PAGE采用4-15%線性梯度分離膠進(jìn)行分離.

1.4 差異蛋白質(zhì)提取

差異蛋白質(zhì)提取方法如文獻(xiàn)[6]所示, 基本過(guò)程如下: (1)脫色: 考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)條帶切下后置于微量離心管中, 用去離子水沖洗兩次后加入 25mmol/L 碳酸氫銨/50%乙腈脫色直至考馬斯亮藍(lán)完全被清除, 吸干溶液后切碎膠塊, 并用 200mmol／L的碳酸氫銨溶液清洗, 用 100%乙腈脫水至膠塊變?yōu)榘咨? 真空干燥. (2)還原和烷基化: 在上述處理的樣品中加入50μL100 mmol/L碳酸氫銨(含DTT 10mmol/L), 57℃保溫l h后室溫冷卻, 除掉過(guò)量溶液, 迅速加入等體積的用100 mmol/L 碳酸氫銨新鮮配制的55mmol／L碘乙酰胺, 暗室常溫反應(yīng)30min, 反應(yīng)完成后用100mmol/L的碳酸氫銨洗滌, 再用100%乙腈脫水后凍干．(3)酶解: TPCK胰蛋白酶用50mmol/L的碳酸氫銨(含5mmol/L CaCl2)配成0.1g/L的溶液, 每管加入10μL酶解液, 待膠塊吸收后將多余酶液吸去, 之后加入20 μL不含酶的緩沖液覆蓋, 于37℃過(guò)夜消化. (4)萃取: 將酶解后的肽用50μL5%TFA/50%ACN 進(jìn)行萃取兩次, 合并萃取液, 凍干后進(jìn)行質(zhì)譜分析.

1.5 Q-TOF MS質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

酶解產(chǎn)物鑒定方法根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行, 質(zhì)譜儀為英國(guó)Micromasss公司生產(chǎn)的電噴霧—四極桿一飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜Micro Q-TOF, 連接毛細(xì)管色譜柱液相色譜儀和鈉升噴霧源. 待測(cè)樣品進(jìn)行全自動(dòng)分析, 經(jīng)Cl8毛細(xì)管柱梯度洗脫后進(jìn)行肽段分離, 本次實(shí)驗(yàn)操作的梯度為一小時(shí)中乙晴濃度從5%至50%, 流速3μL/min,將分離后的肽段直接進(jìn)入ESI離子源, 其中強(qiáng)度超過(guò)閾值的肽段自動(dòng)進(jìn)行MS／MS測(cè)定. 所有MS的數(shù)據(jù)測(cè)定均在正離子模式下進(jìn)行. 質(zhì)譜儀的校正是采用PPG-2000的串聯(lián)碎片校正的, 質(zhì)量誤差為士0.1Da. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)以pk1.的文件格式提交Mascot搜索, 數(shù)據(jù)庫(kù)選NCBInr.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 童蟲(chóng)提取蛋白SDS-PAGE分離

童蟲(chóng)提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色, 結(jié)果如圖1. 采用軟件進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)從東方田鼠和昆明小鼠中分離獲得的童蟲(chóng)有10個(gè)差異條帶. 這些差異條帶在低分子量到高分子量區(qū)間均有分布.

圖1 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)提取蛋白SDS-PAGE分離圖譜

2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索結(jié)果

質(zhì)譜數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)掃描結(jié)果如圖 2所示,可以確定多肽序列和蛋白質(zhì)序列以及蛋白質(zhì)名稱(chēng)等信息. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果見(jiàn)表 1. 由表 1的數(shù)據(jù)可以看出, 日本血吸蟲(chóng)在東方田鼠和昆明小鼠肝臟中差異蛋白質(zhì)主要體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)部分: 如Actin蛋白和Keratin蛋白; 能量代謝蛋白部分: 如蘋(píng)果酸脫氫酶、ATP合酶beta亞基等; 熱休克蛋白部分: 如 HSP60、HSP70、HSP75以及HSP83等蛋白質(zhì). 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)結(jié)構(gòu)蛋白在東方田鼠肝臟內(nèi)表達(dá)水平下調(diào), 據(jù)此可以說(shuō)明東方田鼠可能通過(guò)抑制日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)抑制日本血吸蟲(chóng)發(fā)育. 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)能量代謝蛋白下調(diào), 說(shuō)明日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在東方田鼠體內(nèi)代謝水平低下, 能量代謝受阻, 從而影響日本血吸蟲(chóng)在東方田鼠體內(nèi)發(fā)育. 同時(shí)日本血吸蟲(chóng)在東方田鼠體內(nèi)熱休克蛋白高水平表達(dá), 說(shuō)明東方田鼠體內(nèi)環(huán)境不利于日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)發(fā)育. 從不同類(lèi)型蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異說(shuō)明東方田鼠通過(guò)多途徑、多手段實(shí)現(xiàn)對(duì)日本血吸蟲(chóng)的殺滅作用.從目前日本血吸蟲(chóng)疫苗的研究現(xiàn)狀以及非適宜宿主東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)殺滅作用研究發(fā)現(xiàn), 單一蛋白疫苗在日本血吸蟲(chóng)減蟲(chóng)率和減卵率方面作用有限, 需要通過(guò)開(kāi)發(fā)多價(jià)疫苗才可能達(dá)到抑制日本血吸蟲(chóng)發(fā)育以至殺滅.

圖2 Actin蛋白質(zhì)多肽片段質(zhì)譜解析結(jié)果

表1 日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在東方田鼠和昆明小鼠肝臟差異蛋白質(zhì)

[1] Chitsulo L, Engel D, Montrosor A, et al. The global status of schistoeomissis and its control[J]. Acta Trop, 2000, 27(1): 41～51

[2] 周曉農(nóng), 汪天平, 林丹丹, 等. 我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治研究現(xiàn)狀與發(fā)展戰(zhàn)略思考[J]. 中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志, 2004, 17(1): 1～3

[3] 姚利曉, 林嬌嬌, 蔡幼民, 等. 東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志, 2003, 15(6): 471～473

[4] 賀宏斌, 左家錚, 周利紅. 東方田鼠實(shí)驗(yàn)感染日本血吸蟲(chóng)的研究[J]. 湖南醫(yī)學(xué), 1992, 9(2): 65～67

[5] 袁忠英, 沈玉娟, 曹建平, 等. 東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA文庫(kù)及新基因分析[J]. 中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志, 2008, 20(4): 255～259

[6] 聶東宋, 劉 宇, 吳 喆, 等. 莽山烙鐵頭蛇粗毒雙向凝膠電泳分析[J]. 湖南理工學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 24(1): 48～51

The Differential Proteins of the Hepatic Schistosomula in the Liver of the Microtus Fortis and Mouse

ZHU Zheng-bin1, YU Xin-ling2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang 414006, China; 2. Hunan Institute of Parasite Disease, Yueyang 414000, China)

Microtus fortis is naturally resistant to Schistosoma japonicum．In order to find against Schistosoma japonicum antigen, the Microtus fortis and Kunming mouse are used in this study. They are challenged with cercariae of Schistosoma japonicum. The livers of the microtus fortis and mouse are collected at 11 days after infection. The proteins from the hepatic Schistosomula separated with SDS-PAGE. The differential proteins are analyzed by in-gel digestion and MS/MS identification. The result shows that the structure protein and energy metabolism protein are significantly down-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection. The heat shock proteins are significantly up-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection.

Microtus fortis; hepatic schistosomula; structure protein; energy metabolism protein; heat shock protein

Q516

A

1672-5298(2014)04-0071-03

2014-10-21

湖南省科技廳科研條件創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)(2010[D203])

朱政斌(1962? ), 男, 湖南岳陽(yáng)人, 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)師. 主要研究方向: 生物化工, 有機(jī)合成