李水明，何曼文，王 勇

(1. 深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060；2. 深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060)

亞胺及其相關(guān)離子在區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺殘基中的應(yīng)用

李水明1，何曼文2，王 勇1

(1. 深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060；2. 深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060)

完全從頭測(cè)序要求區(qū)分肽段中的同量異序氨基酸谷氨酰胺和賴氨酸，而這通常需要借助高分辨質(zhì)譜。谷氨酰胺和賴氨酸都可以產(chǎn)生m/z101亞胺離子和m/z84亞胺相關(guān)離子，盡管已知賴氨酸亞胺離子m/z101有時(shí)強(qiáng)度較弱，以及m/z84離子可預(yù)示賴氨酸的存在，但該特征能否用于區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺仍存在爭(zhēng)議。本工作以合成肽段和蛋白質(zhì)胰酶水解肽段為研究體系，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離的高能碰撞誘導(dǎo)解離模式產(chǎn)生的亞胺及其相關(guān)離子的相對(duì)強(qiáng)度區(qū)分這兩種氨基酸。結(jié)果表明：谷氨酰胺更易產(chǎn)生m/z101離子，而賴氨酸更易產(chǎn)生m/z84 和m/z129離子。對(duì)于不同時(shí)含有賴氨酸和谷氨酰胺的肽段，使用m/z84離子與亞胺離子m/z101的相對(duì)強(qiáng)度比值，而非它們的絕對(duì)強(qiáng)度，以及m/z101離子的測(cè)量值，可以直接判斷序列中存在的是賴氨酸還是谷氨酰胺。對(duì)于含有谷氨酰胺，并以賴氨酸結(jié)尾或含有漏切賴氨酸的肽段，該強(qiáng)度比可為序列中谷氨酰胺的個(gè)數(shù)和位置提供參考。因此，低質(zhì)量區(qū)提供的亞胺及其相關(guān)離子信息有助于區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺。

亞胺離子；基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜；賴氨酸；谷氨酰胺；同量異序氨基酸

數(shù)據(jù)庫搜索和從頭測(cè)序是利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)的兩種基本方法[1-2]，盡管數(shù)據(jù)庫搜索在目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為常用，但后者對(duì)于鑒定基因組未測(cè)序生物和高置信度鑒定已知蛋白更為必要[3-5]。完全的從頭測(cè)序不僅要求獲得連續(xù)的子離子序列，還要能夠區(qū)分同量異序的氨基酸或氨基酸組合。準(zhǔn)確測(cè)定生物分子的單同位素質(zhì)量可以獲得肽段的組成信息，例如，區(qū)分質(zhì)量為1 100 u肽段的質(zhì)量準(zhǔn)確度為0.1×10-6(百萬分之一)[6]。賴氨酸(lysine，Lys，K)和谷氨酰胺(glutamine，Gln，Q)是分子質(zhì)量相差36.4 mu的同量異序氨基酸。由于胰蛋白酶特異性水解賴氨酸和精氨酸，在理論上，肽段中間不應(yīng)有賴氨酸殘基，但由于漏切現(xiàn)象，利用質(zhì)譜技術(shù)區(qū)分這兩種氨基酸仍有必要。它們可以被四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜區(qū)分，但是傅里葉變換-離子回旋共振和靜電軌道場(chǎng)離子阱質(zhì)譜是更好的選擇[7-10]。

典型情況下，串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF/TOF)的外標(biāo)法準(zhǔn)確度是5.0×10-5，因此，該類儀器有時(shí)不能區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺[11-12]。然而，在TOF/TOF類儀器上實(shí)現(xiàn)的高能碰撞誘導(dǎo)解離可以為從頭測(cè)序分析提供充分?jǐn)嗔押洼^完全的子離子序列。實(shí)際上，在基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間(MALDI-TOF/TOF)質(zhì)譜中，高能斷裂和低能斷裂都可以發(fā)生，加之其高通量特性和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，該類質(zhì)譜已被廣泛用于蛋白質(zhì)鑒定和蛋白質(zhì)相互作用等研究中[13-18]。高能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)的另一個(gè)顯著特征是可以產(chǎn)生亞胺離子(RCH=NH2+)。早期研究表明，亞胺離子可作為肽段序列中存在或缺少某些特定氨基酸的標(biāo)志[19-20]。然而，利用亞胺離子輔助從頭測(cè)序的研究尚且不多[10]，可能是近年來高分辨和高準(zhǔn)確度質(zhì)譜儀發(fā)展迅速，而TOF/TOF類儀器的準(zhǔn)確度較低[21-22]，也可能是由于離子阱質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的快速發(fā)展，使得亞胺離子的作用被忽略[23]。

基于四極磁質(zhì)譜，F(xiàn)alick等[24]指出，不可能利用m/z84和m/z101離子區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺。然而，Papayannopoulos等[19]認(rèn)為，m/z84離子是序列中存在賴氨酸的可信標(biāo)志。因此，能否利用亞胺離子區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺仍存在爭(zhēng)議，目前大多數(shù)從頭測(cè)序軟件也沒有利用亞胺離子提高分析結(jié)果的確定性。本研究利用合成多肽和蛋白質(zhì)胰酶切的實(shí)際樣品，構(gòu)建了由184個(gè)來源于雙向電泳或純化蛋白的實(shí)際肽段及22個(gè)合成肽段組成的數(shù)據(jù)集，并將數(shù)據(jù)集分成含有谷氨酰胺、賴氨酸和同時(shí)含有這兩種氨基酸三類，探討利用亞胺和亞胺相關(guān)離子相對(duì)強(qiáng)度比和所測(cè)質(zhì)荷比區(qū)分這兩個(gè)同量異序氨基酸的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

4800 MALDI TOF/TOFTMAnalyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Applied Biosystems/MDX Sciex公司產(chǎn)品，配有4700 Series Explorer Software軟件；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

胰蛋白酶(質(zhì)譜級(jí))：美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；α-腈基-4-羥基肉桂酸：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；乙腈和三氟乙酸等試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純；多肽：由上海強(qiáng)耀公司合成。

1.2 膠內(nèi)胰酶水解條件

切膠：將雙向電泳分離后的目標(biāo)條帶用移液槍槍頭切下，小心地放入PCR管中。脫色：用100 μL高純水振蕩洗滌10 min，重復(fù)3次；然后用100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；再用100 μL 25 mmol/L NH4HCO3和50%乙腈室溫振蕩30 min。干燥膠粒：100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；加入5 μL 50%乙腈溶液，讓膠粒脫水；再加100%乙腈，讓膠粒變白完全脫水。酶解：加入5 μL 20 mg/L胰蛋白酶(質(zhì)譜用測(cè)序級(jí))，4 ℃放置30 min，使酶液完全浸透膠粒，吸掉多余的酶液；冰上充分吸漲變透明后，再加入20 μL含10% 乙腈的40 mmol/L NH4HCO3溶液覆蓋，37 ℃水浴恒溫8 h，直接取上清酶解液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 質(zhì)譜分析條件

基質(zhì)制備：將6 g/Lα-腈基-4-羥基肉桂酸和2 g/L檸檬酸氫二胺溶于10 mL 50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)中，V(基質(zhì)溶液)∶V(蛋白酶解液)=1∶1混合后點(diǎn)于不銹鋼靶板，自然干燥結(jié)晶后，待測(cè)。

采用正離子反射模式，一級(jí)質(zhì)譜每張譜圖累加800次，二級(jí)質(zhì)譜累加1 200次，碰撞誘導(dǎo)解離條件為1 kV，碰撞能加空氣碰撞(1 kV, gas on)，源內(nèi)電壓8 kV，碰撞池電壓7 kV，二級(jí)源加速電壓15 kV。

1.4 數(shù)據(jù)分析條件

數(shù)據(jù)庫搜索條件：串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)信噪比設(shè)為5，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量誤差均設(shè)為0.3 u，利用Mascot軟件分析，所用數(shù)據(jù)庫NCBI 于2013年1月發(fā)布，甲硫氨酸氧化和谷氨酸甲基化作為可變修飾。當(dāng)Mascot分?jǐn)?shù)接近或小于可信閾值時(shí)，利用Data Explorer提供的離子碎片計(jì)算器和Protein-Prospector MS-Product program輔助，進(jìn)行人工解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HDLYGK系列肽段的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析

由于亞胺離子相對(duì)強(qiáng)度與肽段序列和儀器條件(如碰撞氣壓力和激光強(qiáng)度)等因素有關(guān)，用亞胺離子m/z101和亞胺相關(guān)離子m/z84的強(qiáng)度比值更能區(qū)分谷氨酰胺和賴氨酸。例如，在肽段HDLYGK的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖中，組氨酸亞胺離子m/z110.08是基峰，而m/z84.08 和m/z101.11離子強(qiáng)度都很弱，分別為4.29%和0.39%，但它們的比值為11，說明賴氨酸確實(shí)更易產(chǎn)生亞胺相關(guān)離子m/z84，而非亞胺離子m/z101，示于圖1a。以亮氨酸亞胺離子m/z86的強(qiáng)度作為參照，發(fā)現(xiàn)在肽段HQDLYGK的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z84離子的強(qiáng)度沒有增加，但m/z101離子的強(qiáng)度顯著增加，同時(shí)，檢測(cè)到的質(zhì)荷比從m/z101.11變?yōu)閙/z101.08，這從強(qiáng)度和質(zhì)荷比兩個(gè)方面說明，m/z101離子主要由谷氨酰胺貢獻(xiàn)，示于圖1b。相反，在肽段HKDLYGK的TOF/TOF譜中，m/z84離子和m/z129離子的強(qiáng)度均明顯高于m/z101.12離子，示于圖1c。類似的，在肽段HQKDLYGK的TOF/TOF譜圖中，m/z101離子強(qiáng)度有所增加，示于圖1d。另一個(gè)例子，在實(shí)際樣品肽段EYWQNLR的串聯(lián)質(zhì)譜中，觀察到了較明顯的m/z101離子，而在肽段KEYWQNLR的串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z84和m/z129離子的相對(duì)強(qiáng)度明顯增加，示于圖2。以上分析提示，賴氨酸和谷氨酰胺之間的替換會(huì)使m/z84離子與m/z101離子的相對(duì)強(qiáng)度比例發(fā)生明顯變化，下面將在較大數(shù)據(jù)集上驗(yàn)證該假設(shè)。

2.2 三種類型肽段中m/z84和m/z129離子與m/z101離子的強(qiáng)度比值分析

本研究共統(tǒng)計(jì)了84個(gè)以精氨酸結(jié)尾的含有1個(gè)或多個(gè)谷氨酰胺的肽段，包括6個(gè)合成肽段和78個(gè)酶解肽段。在84個(gè)串聯(lián)質(zhì)譜圖中都檢測(cè)到了m/z101離子，而m/z84離子僅在67個(gè)肽段的質(zhì)譜圖中被發(fā)現(xiàn)，m/z84與m/z101離子的強(qiáng)度比范圍為1.5～0.056，只有3個(gè)肽段的比值大于1，分別為AQIHDLVLVGGSTR(1.5)，QYDISDTR(1.33)和NQGDHLLHSTR(1.08)。類似的，在82個(gè)肽段的串聯(lián)質(zhì)譜中檢測(cè)到了m/z129離子，大多數(shù)情況下，m/z129離子的相對(duì)強(qiáng)度均小于m/z101離子，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示為0.467±0.384。以上結(jié)果說明，對(duì)于含有谷氨酰胺但不含賴氨酸殘基的肽段，m/z101離子的強(qiáng)度在大多數(shù)情況下高于m/z84和m/z129離子。3個(gè)例外情況下，谷氨酰胺位于氨基端的第1位或第2位，在實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，位置效應(yīng)和肽段結(jié)構(gòu)的特殊性可能是造成這種例外的原因，即，如果谷氨酰胺或賴氨酸位于N端附近，可能容易生成亞胺相關(guān)離子m/z84。為此，合成了肽段QMNGTFR和KMNGTFR進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜比較，結(jié)果示于圖3。

注：a. HDLYGK；b. HQDLYGK低質(zhì)量區(qū)；c. HKDLYGK低質(zhì)量區(qū)；d. HQKDLYGK低質(zhì)量區(qū)圖1 合成肽段HDLYGK系列的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜圖Fig.1 The MALDI-TOF/TOF spectra of synthetic peptides of HDLYGK series

圖2 酶切肽段EYWQNLR(a)和KEYWQNLR(b)的低質(zhì)量區(qū)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜圖Fig.2 The low mass region of MALDI-TOF/TOF spectrum of digest peptide EYWQNLR (a) and KEYWQNLR(b)

圖3 合成肽段QMNGTFR(a)和KMNGTFR(b)的低質(zhì)量區(qū)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜圖Fig.3 The low mass region of MALDI-TOF/TOF spectrum of synthetic peptide QMNGTFR(a) and KMNGTFR(b)

在肽段QMNGTFR的TOF/TOF譜圖中，谷氨酰胺亞胺離子m/z101.08的豐度僅略高于亞胺相關(guān)離子m/z84.06，未明顯觀察到m/z129離子。這是由于肽段較短，斷裂充分，并且谷氨酰胺位于肽段氨基端。而對(duì)于肽段KMNGTFR，這種趨勢(shì)更為明顯，m/z84.09離子在低質(zhì)量區(qū)是最高峰，而賴氨酸亞胺離子m/z101.11強(qiáng)度較低，還觀察到了明顯的m/z129離子。

在63個(gè)含有賴氨酸但不含有谷氨酰胺的肽段中，48個(gè)肽段僅含有1個(gè)賴氨酸殘基，其中33個(gè)以賴氨酸結(jié)尾，13個(gè)以精氨酸結(jié)尾，另外2個(gè)以絲氨酸或甘氨酸結(jié)尾；剩余的15個(gè)肽段以賴氨酸結(jié)尾，但在序列中還含有另外1個(gè)賴氨酸殘基，造成這種現(xiàn)象的原因多為2個(gè)賴氨酸殘基相鄰或者賴氨酸與天冬氨酸(E)相鄰。在這63個(gè)肽段的TOF/TOF譜圖中，均檢測(cè)到了m/z84離子，而m/z101和m/z129離子的檢測(cè)頻次分別是38次和57次。m/z84與m/z101離子的強(qiáng)度比為1.37～25.6，平均值為4.24；而m/z84與m/z129的離子強(qiáng)度比值的平均值為1.06。因此，用m/z84和m/z129離子同時(shí)具有較高強(qiáng)度判定肽段中存在賴氨酸殘基更為可靠。

當(dāng)肽段序列中同時(shí)存在賴氨酸和谷氨酰胺時(shí)，離子強(qiáng)度的比值可看作是上述2種情況的疊加，用10個(gè)合成肽段和49個(gè)酶切肽段構(gòu)成了這個(gè)數(shù)據(jù)集。在總共59個(gè)多肽質(zhì)譜圖中，均檢測(cè)到m/z101離子，而m/z84 和m/z129離子分別在53個(gè)和57個(gè)肽段中被觀察到。m/z84與m/z101離子的相對(duì)強(qiáng)度比值的最小值是0.208，對(duì)應(yīng)肽段QVQAVQQFEVK；最大值是7.46，對(duì)應(yīng)肽段VYVEELKPTPEGDLEILLQK，平均值是0.72。當(dāng)肽段中同時(shí)存在賴氨酸和谷氨酰胺時(shí)，較難像上述2種情況下利用離子強(qiáng)度的比值進(jìn)行直接判斷，這時(shí)需結(jié)合谷氨酰胺的個(gè)數(shù)和位置以及賴氨酸的漏切進(jìn)行綜合分析?？傮w上，谷氨酰胺個(gè)數(shù)越多或越接近于N端，其對(duì)m/z101離子的貢獻(xiàn)越大，亞胺離子在TOF/TOF質(zhì)譜中的位置效應(yīng)將在后繼工作中分析。

2.3 三種類型肽段中所測(cè)m/z101離子質(zhì)荷比的差別

賴氨酸和谷氨酰胺亞胺離子的理論質(zhì)荷比分別是m/z101.107 3和m/z101.070 9，區(qū)分二者要求3.6×10-5的準(zhǔn)確度，串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜有可能達(dá)到該指標(biāo)。在外標(biāo)法條件下，對(duì)于84個(gè)含有谷氨酰胺肽段、63個(gè)含有賴氨酸肽段和59個(gè)同時(shí)含有這2個(gè)氨基酸殘基的肽段，檢測(cè)到的m/z101離子的質(zhì)荷比平均值分別是101.078 1±0.008 1，101.103±0.033 4和101.082±0.010 2。該結(jié)果說明，串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)到的m/z101離子的質(zhì)荷比，對(duì)于判斷序列中這2種同量異序氨基酸殘基具有一定參考作用，由于m/z101離子主要由谷氨酰胺貢獻(xiàn)，在同時(shí)含有谷氨酰胺和賴氨酸的肽段中，其質(zhì)荷比更接近與谷氨酰胺的理論值。

3 結(jié)論

本研究利用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的高能碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)產(chǎn)生的亞胺離子和亞胺相關(guān)離子的強(qiáng)度比區(qū)分谷氨酰胺和賴氨酸。該類儀器有2種操作模式：即加碰撞氣和不加碰撞氣，二者在數(shù)據(jù)庫檢索模式下的結(jié)果差別不大，但前者對(duì)于從頭測(cè)序更為合適，因?yàn)槠涮峁┝烁鼮樨S富的斷裂和亞胺離子信息，還可確認(rèn)翻譯后修飾的鑒定結(jié)果[25]。研究發(fā)現(xiàn)，相比于賴氨酸，谷氨酰胺更容易產(chǎn)生m/z101離子，而賴氨酸更易形成m/z84 和m/z129離子，當(dāng)存在非C端賴氨酸時(shí)，這種趨勢(shì)尤為明顯，這是因?yàn)閬啺冯x子強(qiáng)度隨著其與N端距離的增加而減弱[23]。 因此, 相對(duì)較強(qiáng)的m/z101離子提示序列中存在谷氨酰胺，而相對(duì)較強(qiáng)的m/z84和m/z129離子則預(yù)示存在賴氨酸漏切。

與前人工作相比，本研究使用離子相對(duì)強(qiáng)度比值而非相對(duì)強(qiáng)度值作為判斷數(shù)據(jù)，這是因?yàn)槎喾N因素影響目標(biāo)離子的相對(duì)強(qiáng)度。例如，肽段很長(zhǎng)時(shí)，所有低質(zhì)量區(qū)的離子強(qiáng)度都下降，此外，以脯氨酸結(jié)尾的y離子可能為基峰，也抑制了亞胺離子和亞胺相關(guān)離子的強(qiáng)度，因此，比較相對(duì)強(qiáng)度更為合理，它反映了排除儀器條件和序列特異性后，2種同量異序氨基酸的自身斷裂特性。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，樣品對(duì)亞胺離子強(qiáng)度的影響較小，只要檢測(cè)器信號(hào)不出現(xiàn)飽和，該規(guī)律都適用。此外，m/z101離子的測(cè)量值也可能為區(qū)分賴氨酸和谷氨酰胺提供線索。盡管MALDI-TOF質(zhì)譜只具有中等質(zhì)量分辨率和準(zhǔn)確度，但如果充分利用亞胺離子信息，則有可能發(fā)揮其操作簡(jiǎn)便和高通量的特性，為完全從頭測(cè)序提供更多信息。

[1] PEVTSOV，F(xiàn)EDULOVA I，MURZAEI H，et al. Performance evaluation of existing de novo sequencing algorithms [J]. Proteome Research，2006，5(11)：3 018-3 028.

[2] MENSCHAERG，VANDEKERCKHOV T T M，BAGGERMANG，et al. A hybrid, de novo based, genome-wide database search approach applied to the sea urchin neuropeptidome [J]. J Proteome Res，2010，9(2)：990-996.

[3] CARPENTIER S C，PANISB，VERTOMMEN A，et al. Proteome analysis of non-model plants: A challenging but powerful approach [J]. Mass Spectrom Rev, 2008，27(4)：354-377.

[4] STANDING K G. Peptide and protein de novo sequencing by mass spectrometry[J]. Curr Opin Stru Biol, 2003，13(5)：595-601.

[5] SAVITSK M M， NIELSEN M L， KJELDSEN F， et al. Proteomics-grade de novo sequencing approach[J]. J Proteome Res, 2005，4(6)：2 348-2 354.

[6] SPENGLER B. De novo sequencing, peptide composition analysis, and composition-based sequencing:a new strategy employing accurate mass determination by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry[J]. J Am Soc Mass Spectrum, 2004, 15(5)：703-714.

[7] SEIDLER J，ZINN N，BOEHM M E，et al. De novo sequencing of peptides by MS/MS[J]. Proteomics, 2010，10(4)：634-649.

[8] HORN D M，ZUBAREV R A，MCLAFFERTY F W. Automated de novo sequencing of proteins by tandem high-resolution mass spectrometry [J]. Proc Natl Acad Sci, 2000，97(19)：10 313-10 317.

[9] HAM B M. Even electron mass spectrometry with biomolecule applications[M]. USA： John Wiley & Sons Inc, 2008.

[10] CHI H，SUN R X，YANG B，et al. De novo peptide sequencing and identification using HCD spectra[J]. J Proteome Res, 2010，9(5)：2 713-2 724.

[11] OLSEN M T， EPSTEIN J A， YERGEY A L. De novo peptide sequencing using exhaustive enumeration of peptide composition[J]. J Am Soc Mass Spectrum, 2006，17(8)：1 041-1 049.

[12] RASH L D， MORALES R A V， VINK S， et al. De novo sequencing of peptides from the parotid secretion of the cane toad, Bufo marinus (Rhinella marina) [J]. Toxicon, 2011，57(2)：208-216.

[13] STIMSON E， TRUONG O， RICHERW J， et al. Enhancement of charge remote fragmentation in protonated peptides by high-energy MALDI-TOF-MS “cold” matrices [J]. Int J Mass Spectrom Ion Process, 1997，(169/170)：231-240.

[14] YATESJ R， ENG J K， CLAUSER K R， et al. Search of sequence databases with uninterpreted high-energy collision-induced dissociation soectra of peptides[J]. J Am Soc Mass Spectrum, 1996, 7(11)：1 089-1 098.

[15] MEDZIHRADSEKY K F， CAMPBELL J M， BA- LDWIN M A， et al. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer[J]. Anal Chem, 2000，72(3)：552-558.

[16] VESTAL M L， CAMPBELL J M. Tandem time-of-flight mass spectrometry[J]. Methods in enzymology，2005，402：79-108.

[17] KHATUN J， RAMKISSOON K， GIDDINGSM C. Fragmentation characteristics of collision-induced dissociation in MALDI TOF/TOF mass spectrometry[J]. Anal Chem, 2007，79(8)：3 032-3 040.

[18] HUANG L， BALDWIN M A， MALTBY D A， et al. The identification of protein-protein interactions of the nuclear pore complex of saccharomyces cerevisiae using high throughput matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Mol Cell Proteomics, 2002，1(6)：434-450.

[19] PAPAYANNOPOULOS I A. The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides[J]. Mass Spectrom Rev, 1995，14(1)：49-73.

[20] MEDZIHRADSZKYE K F. Peptide sequence analysis[J]. Methods in Enzymology，2005，402：209-244.

[21] BERKOUT V D. Fragmentation of singly protonated peptides via interaction with metastable rare gas atoms[J]. Anal Chem, 2009，81(2)：725-731.

[22] YERGEY A L， COORSSEN J R， BACKLUND P S， et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF[J]. J Am Soc Mass Spectrum，2002，13(7)：784-791.

[23] HOHMANN L J，ENG J K，GEMMILL A，et al. Quantification of the compositional information provided by immonium ions on a quadrupole-time-of flight mass specrometer[J]. Anal Chem, 2008, 80(14)：5 596-5 606.

[24] FALICK A M，HINES W M，MEDZIHRADSZKY K F，et al. Low-mass ions produced from peptides by high-energy collision-induced dissociation in tandem mass spectgrometry[J]. J Am Soc Mass Spectrum, 1993, 4(11)：882-893.

[25] 王 勇，李水明，何曼文. 溶菌酶基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析中的不常見修飾及脫水反應(yīng)[J]. 分析化學(xué)，2013，41(4)：494-499. WANG Yong，LI Shuiming，HE Manwen. The uncommon modifications and dehydration reaction in the analysis of lysozyme by matrix-assisted laser desorption ionization tandem time of flight mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013，41(4)：494-499(in Chinese).

Application of Immonium and Their Related Ions in Differentiation of Lysine and Glutamine Residues

LI Shui-ming1, HE Man-wen2, WANG Yong1

(1.CollegeofLifeScience,ShenzhenKeyLaboratoryofMarineBioresourcesandEcology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China;2.CollegeofLifeScience,ShenzhenKeyLaboratoryofMicrobialGeneticEngineering,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Differentiation of isobaric glutamine (Gln) and lysine (Lys) is needed for complete de novo sequencing and require high resolution mass spectrometry generally. Both Gln and Lys can produce immonium ions atm/z101 and their related ions atm/z84. Although it is known that the peak atm/z101 due to Lys is sometimes weak and abundant ions atm/z84 is a good indicator of the presence of Lys, whether this feature can be used to discriminate Lys and Gln is still a controversial issue. In this study, investigations were used to distinguish Gln and Lys based on immonium and immonium-related ions produced by matrix-assisted laser desorption ionization tandem time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) with high energy collision induced dissociation (CID). The work focused on a series of synthetic peptides and 184 tryptic peptides. The result shows that Gln is more prone to generate immonium ions atm/z101comparede to Lys, which generatesm/z84 andm/z129 ions mainly. It is the ratios of intensity ofm/z101 ion versusm/z84, rather than the intensity value of them, can be used to distinguish Gln versus Lys for practical samples for those peptides that containing Lys or Gln, or provide clue for the number and position of Gln for Lys-terminated peptides. Additionally, the mass measurement atm/z101 is also relevant for distinguishing Lys and Gln. This observation has demonstrated that the usefulness of low mass region information of TOF/TOF spectra in distinguishing isobaric Lys and Gln.

immonium ions; matrix-assisted laser desorption ionization tandem time-of flight mass spectrometry; lysine; glutamine; isobaric amino acids

2013-08-12；

2013-09-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(21271131; 31070731)資助

李水明(1979～)，男(漢族)，湖南人，工程師，從事生物質(zhì)譜分析研究。E-mail: 414004365@qq.com

王 勇(1970～)，男(漢族)，吉林人，副教授，從事生物質(zhì)譜分析研究。E-mail: wyong@szu.edu.cn

時(shí)間：2014-03-24； 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7538/zpxb.youxian.2014.0018.html

O 657.63

A

1004-2997(2014)03-0256-06

10.7538/zpxb.youxian.2014.0018