張洪旺， 張寶剛， 宋瑞卉， 王漢秋， 郭文君

(濰坊醫(yī)學院病理教研室，山東 濰坊 261053)

Raptor對膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響

張洪旺， 張寶剛， 宋瑞卉， 王漢秋， 郭文君△

(濰坊醫(yī)學院病理教研室，山東 濰坊 261053)

目的： 研究Raptor對于膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響。方法: 采用RNA干擾技術(shù)，向膠質(zhì)瘤U87細胞轉(zhuǎn)染Raptor限定性siRNA干擾質(zhì)粒， Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后細胞Raptor的表達水平以鑒定轉(zhuǎn)染效果。體外侵襲實驗檢測Raptor表達降低后，U87細胞侵襲能力的變化；Western blotting檢測細胞中ARK5的磷酸化情況和MMP-2、MMP-9的表達水平。免疫組織化學法檢測低級別及高級別膠質(zhì)瘤中Raptor的表達水平。結(jié)果: 轉(zhuǎn)染Raptor siRNA質(zhì)粒的U87細胞命名為siRaptor/U87，轉(zhuǎn)染對照組質(zhì)粒的細胞命名為Scr/U87，轉(zhuǎn)染成功的實驗組細胞Raptor的表達降低。體外侵襲實驗中siRaptor/U87較對照組穿透基質(zhì)膜的細胞數(shù)少(P<0.01)。Western blotting顯示實驗組細胞中磷酸化ARK5、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平均較對照組低。膠質(zhì)瘤組織中Raptor的表達與惡化程度存在相關(guān)性(P<0.01)。結(jié)論: Raptor 表達降低可能通過磷酸化ARK5及增加MMP-2、MMP-9的表達促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲力。

Raptor蛋白； 膠質(zhì)瘤； 腫瘤侵襲； 哺乳動物霉帕雷素靶蛋白； AMPK相關(guān)激酶5； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

Raptor是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的一種調(diào)控蛋白。1993年，Hara等[1]證實了mTOR于酵母菌屬真菌細胞中的存在，1994年，Brown等[2]通過實驗鑒定了mTOR(亦稱FRAP、RAFT1或RAPT)基因及蛋白產(chǎn)物。mTOR屬磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)蛋白激酶家族，是PI3K/PKB信號通路的下游效應蛋白，在細胞中有廣泛而重要的作用。Raptor與mLst8、FKBP38、Deptor、PRAS40結(jié)合mTOR在細胞中以復合物形式存在，能夠連接mTOR與下游效應蛋白，磷酸化S6激酶1(S6 kinase 1，S6K1)和真核生物起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4E2BP1)，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達，從而改變細胞的生長和增殖狀態(tài)，推測其亦能影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。有研究表明，AMPK相關(guān)激酶 5(AMPK-related kinase 5，ARK5)可以通過基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和MMP-9在膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，聯(lián)系之前實驗對ARK5蛋白的研究[3]，可以幫助探究mTOR-Raptor在膠質(zhì)瘤細胞侵襲中的機制。本實驗通過RNA干擾技術(shù)降低膠質(zhì)瘤細胞系Raptor的表達并觀察細胞侵襲能力變化，檢測ARK5及其下游蛋白表達水平，探求mTOR-Raptor復合物在膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

收集濰坊醫(yī)學院病理學教研室2008～2012年的膠質(zhì)瘤蠟塊標本共52例，均經(jīng)病理證實，其中低級別膠質(zhì)瘤(WTOⅠ、Ⅱ級)22例，高級別膠質(zhì)瘤(WTO Ⅲ、Ⅳ級)30例。所有患者的臨床及病理資料齊全，并且術(shù)前均未經(jīng)放療、化療。

2 主要試劑

培養(yǎng)基及相關(guān)試劑購自HyClone；Raptor限定性siRNA質(zhì)粒和對照組siRNA質(zhì)粒購自Genescript；細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen；24孔趨化小室購自康寧世紀公司；Matrivgel購自北京威格拉斯公司；人EGF購自R&D；抗Raptor、MMP-2和MMP-9抗體購自北京中衫金橋公司；抗p-ARK5和ARK5抗體購自Santa Cruz。

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng)和處理 人類膠質(zhì)瘤細胞系U87購自ATCC，細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行無菌培養(yǎng)。在加入完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染之前24 h，將2×105U87細胞種植于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。依據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000試劑進行轉(zhuǎn)染，siRNA Raptor目標片段為5’-TATTTGGTCGTCCAATCTCGT-3’[4]，對照組轉(zhuǎn)染插入SCR序列的siRNA質(zhì)粒(SCR/U87)。轉(zhuǎn)染的實驗組和對照組細胞分別命名為siRaptor/U87和U87。培養(yǎng)72 h后，用Western blotting評價存活細胞Raptor的表達。

3.2 體外侵襲實驗 按照文獻所述方法進行Boyden小室侵襲實驗[5]。小室碳酸脂膜(8 μm)表面鋪上一層以1.5 g/L濃度配制的基底膜基質(zhì)。將siRaptor/U87和對照組SCR/U87細胞分別懸浮于無血清培養(yǎng)基中，濃度為4×108/L，37 °C孵育30 min后加入上室。下室加入約300 μL趨化介質(zhì)(RPMI-1640，0.1%牛血清白蛋白和25 mmol/L HEPES)。37 °C、5% CO2孵育24 h，對侵襲至膜下表面的細胞進行固定和染色。400倍光鏡下計數(shù)5塊預定區(qū)域內(nèi)侵襲至基質(zhì)膜濾膜底面的細胞數(shù)，取其平均值。所有實驗重復3遍。

3.3 Western blotting實驗 U87、SCR/U87和si-Raptor/U87細胞在無血清培養(yǎng)基中分別用10 μg/L的表皮生長因子刺激30 min，使用1×十二烷基硫酸鈉樣品緩沖液溶解，提取總蛋白，蛋白變性后經(jīng)過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯影得到蛋白印跡，分析ARK5的磷酸化情況。使用之前實驗抽提的SCR/U87和siRaptor/U87細胞蛋白，再次進行 Western blotting實驗，分析2組細胞中MMP-2和MMP-9表達水平。所有實驗重復3次。

3.4 免疫組化實驗 根據(jù)說明書利用鏈霉親和素過氧化物酶免疫組化分析測定所有膠質(zhì)組織標本Raptor表達。石蠟切片的染色程度同時基于染色的強度和陽性細胞的比例，由2個觀察者獨立評估計分[6]。單個細胞的染色強度以如下標準衡量：0(不染色)；1(弱染色，淡黃色)；2(中等染色，黃棕色)；3(強染色、棕色)。陽性細胞比例以如下標準分級：0(沒有陽性細胞)；1(陽性細胞數(shù)< 10%)；2(陽性細胞數(shù)10%～50%)；3(陽性細胞數(shù)> 50%)。染色指數(shù)計算方式如下：染色指數(shù)=染色強度×染色陽性細胞比例。通過染色指數(shù)評估Raptor的表達(得分為0、1、2、3、4、6、7)，以染色指數(shù)得分≥ 6標志腫瘤高表達Raptor，染色指數(shù)≤4標志腫瘤低表達Raptor。

4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0軟件。定量數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料采用兩個獨立樣本的t檢驗；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染siRaptor 降低U87細胞中Raptor的表達

應用RaptorsiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h，轉(zhuǎn)染成功后的U87細胞Raptor蛋白表達降低，見圖1。

Figure 1.The expression of Raptor in U87, siRaptor/U87 and SCR/U87 cells detected by Western blotting. β-actin was used as an internal reference.

圖1 Western blotting法檢測各組細胞中Raptor 的表達情況

2 降低U87細胞中Raptor的表達導致U87細胞侵襲能力下降

使用轉(zhuǎn)染成功的siRaptor/U87細胞與對照組細胞進行侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)siRaptor/U87組比Scr/U87組穿透濾膜的細胞數(shù)減少，差異顯著(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect ofRaptorknockdown on invasion ability of U87 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsSCR/U87.

圖2 干擾Raptor的表達對U87細胞侵襲能力的影響

3 siRaptor/U87細胞中ARK5的磷酸化水平

結(jié)果顯示，siRaptor/U87較對照組細胞ARK5的磷酸化減少，見圖3。

Figure 3.The expression of p-ARK5 protein and ARK5 protein in siRaptor/U87 and SCR/U87 detected by Western blotting.

圖3 Western blotting法檢測siRaptor/U87與對照組細胞中ARK5的磷酸化水平

4 siRaptor/U87細胞中MMP-2和MMP-9的表達

結(jié)果顯示，siRaptor/U87較對照組細胞MMP-2和MMP-9的表達下調(diào)，見圖4。

Figure 4.The expression of MMP-2 and MMP-9 in siRaptor/U87 cells and SCR/U87 detected by Western blotting. β-actin as an internal reference.

圖4 Western blotting法檢測siRaptor/U87與對照組細胞中MMP-2和MMP-9的表達情況

5 膠質(zhì)瘤組織中Raptor蛋白的表達

免疫組織化學染色的52例膠質(zhì)組織在顯微鏡下觀察，正常膠質(zhì)組織沒有或極少表達Raptor，惡化程度高的膠質(zhì)瘤細胞Raptor的表達要高于惡化程度低的膠質(zhì)瘤細胞，見圖5。統(tǒng)計分析顯示，Raptor的表達與膠質(zhì)瘤是否發(fā)生惡性細胞變化具有相關(guān)性(P<0.01)，見表1。

討 論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一類腫瘤，其平均生存時間在12～15個月之間[7]，被稱為人類最具危害性的腫瘤。而腫瘤惡性程度與腫瘤細胞的侵襲有關(guān)，因此研究膠質(zhì)瘤細胞的侵襲對提高治療功效具有重要的作用[8-9]。Raptor具有潛在的原癌基因特性，在人類乳腺癌、前列腺癌[10]中高表達但尚未見Raptor與膠質(zhì)瘤侵襲相關(guān)研究。明確Raptor在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用，對抑制膠質(zhì)瘤的侵襲具有重要作用。同時實驗證實，Raptor在膠質(zhì)瘤中的表達具有正相關(guān)性，即：Raptor高表達時，通過RNA 干擾技術(shù)將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤，培養(yǎng)72 h后，轉(zhuǎn)染成功后的U87細胞Raptor蛋白表達降低。為研究Raptor與ARK5之間的關(guān)系我們進行了分子生物學實驗，通過RNA 干擾技術(shù)使用小干擾RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株，Western blotting 檢測到Raptor表達降低，成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默Raptor表達的細胞系。體外癌細胞侵襲實驗證明Raptor參與了癌細胞的侵襲過程。Raptor降低表達的實驗組細胞ARK5的磷酸化減少，MMP-2和MMP-9的表達相應降低。通過免疫組化實驗表明：Raptor在高級膠質(zhì)瘤(WTO分級為Ⅲ、Ⅳ)中的表達明顯高于在低級膠質(zhì)瘤(WTO分級為Ⅰ、Ⅱ)中的表達。以上實驗結(jié)果表明，Raptor可以磷酸化ARK5，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，從而調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。對侵襲機制的研究可為膠質(zhì)瘤的防治提供參考，為明確Raptor在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用及與侵襲相關(guān)的下游信號分子之間的相互關(guān)系，我們將進行進一步實驗。

Figure 5.The expression of Raptor in tissues of grade I, grade II, grade III and grade IV gliomas(×400).

圖5 I、II、III和IV級膠質(zhì)瘤組織中Raptor的表達

表1 Raptor的表達與膠質(zhì)瘤惡化程度的關(guān)系

Table 1.The relationship between Raptor expression and degree of deterioration of glioma

WTOclassificationgradenRaptorHighPositiverateNegativeorexpression(%)lowexpressionI,II221560.826III,IV3022**82.098

**P<0.01vsI，II.

[1] Hara K, Maruki Y, Long X， et al. Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action[J]. Cell, 2002, 110(2):177-189.

[2] Brown EJ, Albers MW, Shin TB, et al. A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex[J]. Nature，1994, 369(6483):756-758.

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[4] Chen P, Li K, Liang Y, et al. High NUAK1 expression correlates with poor prognosis and involved in NSCLC cells migration and invasion[J]. Exp Lung Res， 2013, 39(1):9-17.

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Effect of Raptor on invasion ability of glioma cells

ZHANG Hong-wang, ZHANG Bao-gang, SONG Rui-hui, WANG Han-qiu, GUO Wen-jun

(DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail: 13963663745@163.com)

AIM: To study the influence of Raptor on the invasion ability of glioma cells. METHODS: The technique of RNA interference was used. U87 cells were transfected with Raptor restricted siRNA plasmid, and the expression level of Raptor in the transfected cells was detected by Western blotting. The invasive ability of the cancer cellsinvitrowas determined. The phosphorylation level of ARK5 and the expression of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotting. The expression levels of Raptor in the tumor samples of low-grade gliomas (WTO grade I and grade II) and high-grade gliomas (WTO grade III and grade IV) were also analyzed by immunohistochemical staining. RESULTS:RaptorsiRNA was transfected into U87 cells and the cells were named siRaptor/U87 cells. The cells transfected with the control plasmid was named Scr/U87 cells. The expression level of Raptor in siRaptor/U87 cells was lower than that in Scr/U87 cells. The results of invitroinvasion assay showed that the number of siRaptor/U87 cells penetrating the Matrivgel matrix membrane was less than that of Scr/U87 cells (P<0.01). The protein expression of MMP-2 and MMP-9, and phosphorylation of ARK5 protein in the cells in the experimental group were lower than those in control group. The correlation between the expression of Raptor in gliomas and the degree of deterioration was also observed (P<0.01). CONCLUSION: The expression of Raptor may contribute to the invasion ability of glioma cells by phosphorylation of ARK5 and increase in the levels of MMP-2 and MMP-9.

Raptor protein; Glioma; Neoplasm invasiveness; Mammalian target of rapamycin; AMPK-related kinase 5; Matrix metalloproteinase-2; Matrix metalloproteinase-9

1000- 4718(2014)12- 2280- 04

2014- 06- 06

2014- 10- 16

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.030

△通訊作者 Tel: 0536-8068957； E-mail: 13963663745@163.com