方 芳， 馮 淳， 姚 楊， 馬瀟瀟， 王立國

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

CD147對前列腺癌PC-3細胞自噬的影響*

方 芳1， 馮 淳1， 姚 楊1， 馬瀟瀟1， 王立國2△

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

目的： 研究白細胞分化抗原(CD)147在體外對前列腺癌PC-3細胞的自噬作用。方法: 通過氨基酸饑餓法建立自噬模型，免疫印跡技術(shù)檢測CD147的表達。利用RNA干擾CD147表達的細胞系，免疫印跡技術(shù)檢測自噬蛋白LC3-I和LC3-II的表達；臺盼藍排斥實驗檢測細胞的死亡情況。結(jié)果: 在PC-3細胞自噬模型中，隨著饑餓誘導(dǎo)時間延長，CD147表達逐漸升高。用RNA干擾技術(shù)降低CD147表達后，與陰性對照組比較，在自噬模型中CD147干擾組自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達增多；并且細胞死亡數(shù)量明顯增加，陰性對照組細胞死亡率分別為(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干涉組細胞死亡率為(38.4±3.1)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: 在前列腺癌PC-3細胞中CD147抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬，減少自噬性細胞死亡的發(fā)生。

抗原, CD147； PC-3細胞； 自體吞噬

自噬是細胞內(nèi)衰老或受損的細胞器或長壽命蛋白被包裹運送到溶酶體降解的過程，通過自噬實現(xiàn)自我更新和維持穩(wěn)態(tài)的一個重要機制。CD147在前列腺癌細胞中表達升高，其作用為抑制腫瘤細胞凋亡[1]、促進腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[2]、血管生成[3]和參與腫瘤細胞的能量代謝等[4]。研究表明，CD147在肝癌細胞中能夠抑制自噬的發(fā)生，防止過度自噬導(dǎo)致的細胞死亡，對腫瘤細胞具有保護作用[5]。但CD147是否參與前列腺腫瘤細胞的自噬還不清楚。本研究旨在觀察CD147對前列腺癌細胞自噬功能的影響，以探討其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

RNA干擾CD147穩(wěn)定表達前列腺癌PC-3細胞株由本實驗室保存[6]； DMEM-F12 培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)購自Invitrogen；兔抗CD147、LC3 和β-actin抗體購自GeneTex；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA、PMSF、BSA 和Bradford 法蛋白測定試劑盒均購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) 前列腺癌PC-3細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，融合度達80% 時傳代。

2.2 前列腺癌饑餓誘導(dǎo)自噬模型建立 細胞接種到6孔板，37 ℃、5% CO2孵育24 h。細胞用EBSS緩沖液洗滌2次，加入2 mL EBSS緩沖液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細胞建立饑餓缺乏誘導(dǎo)的自噬細胞模型[7]。

2.3 Western blotting檢測CD147和LC3 蛋白的表達 取30 μg蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L 脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗CD147和LC3 抗體(1∶1 000)，小鼠抗β-actin 抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。TBST 洗膜，分別加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h。TBST 洗膜后，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

2.4 細胞死亡的檢測 將細胞接種到24孔培養(yǎng)板中，加入EBSS緩沖液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)板中細胞用消化液消化并離心收集細胞，取100 μL細胞懸液，加100 μL 0.8%臺盼藍溶液，混勻，每個樣品至少計數(shù)200個細胞，并重復(fù)3次，藍色細胞被記為死亡細胞，迅速用計數(shù)板計數(shù)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較行方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PC-3細胞自噬模型中CD147的表達變化

圖1 所示， PC-3細胞用EBSS饑餓3 h、6 h、9 h、12 h和24 h后，結(jié)果表明隨著饑餓時間延長，CD147蛋白表達逐漸升高，提示CD147分子參與饑餓誘導(dǎo)的PC-3細胞自噬。

2 CD147抑制饑餓誘導(dǎo)細胞的自噬

細胞在EBSS中培養(yǎng)12 h后，與陰性對照組PC-3 和PC-3/scrambled細胞比較，CD147干擾組細胞LC3-II的表達顯著提高，LC3-II/LC3-I比值提高(P<0.05),見圖2，提示沉默CD147的表達后，前列腺癌細胞自噬顯著增高。

Figure 1.Change of CD147 expression by starvation-induced autophagy in PC-3 cells detected by Western blotting.

圖1 PC-3細胞饑餓后CD147蛋白表達的變化

Figure 2.Western blotting analysis of LC-3 protein level in the PC-3 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC-3 or PC-3/scrambled.

圖2 PC-3細胞LC3蛋白的表達

3 CD147抑制饑餓誘導(dǎo)自噬性細胞死亡

細胞在EBSS培養(yǎng)12 h后結(jié)果表明，陰性對照組PC-3和PC-3/scrambled細胞死亡率分別為(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干擾組PC-3/shCD147細胞死亡率為(38.4±3.1)%，與陰性對照組比較有顯著差異(P<0.05)。這提示在饑餓誘導(dǎo)的自噬中CD147能增強細胞存活。

討 論

自噬是指細胞在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下通過消化自身細胞內(nèi)的蛋白、細胞器和胞質(zhì)以渡過饑餓的行為，因此自噬被認為是細胞的一種保護性作用?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)自噬雖然對細胞具有保護作用，但過度的自噬可導(dǎo)致細胞死亡, 而這被認為是區(qū)別于細胞凋亡( I 型程序性死亡) 的另外一種細胞程序性死亡形式( II 型程序性死亡)，稱為自噬性細胞死亡。腫瘤細胞發(fā)生自噬后會出現(xiàn)2種不同的結(jié)果: 一種是保護細胞防止周圍環(huán)境帶來的損害; 另一種是啟動自噬性細胞死亡程序[8]。目前, 對于這2種不同結(jié)果的產(chǎn)生還沒有發(fā)現(xiàn)特定的規(guī)律。如果可以誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生自噬, 繼而引起細胞死亡, 可以消除自噬對腫瘤細胞的保護作用, 將對腫瘤的治療帶來一個新的途徑。

CD147是一個分子量為50～60 kD的單次跨膜糖蛋白，屬于IgSF成員。CD147在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞中高表達，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及能量代謝和物質(zhì)代謝?，F(xiàn)研究表明，CD147在肝癌細胞中能夠抑制自噬的發(fā)生，防止過度自噬導(dǎo)致的細胞死亡，對腫瘤細胞具有保護作用[8]。因此，CD147 被認為是腫瘤發(fā)展進程中一個重要的分子。

為了研究CD147在前列腺癌細胞中對自噬作用的影響，我們通過RNAi干擾技術(shù)建立的穩(wěn)定低表達CD147的細胞系。通過EBSS培養(yǎng)細胞建立細胞自噬模型，我們研究發(fā)現(xiàn)隨著饑餓時間延長，CD147表達逐漸增高，證明CD147參與了細胞自噬的發(fā)生。LC3蛋白是酵母自噬相關(guān)蛋白8的同源蛋白，在合成后其C 末端即被酵母自噬相關(guān)蛋白4蛋白酶切割轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅰ并散在分布于細胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并始終穩(wěn)定地錨定于自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變代表了自噬的誘導(dǎo)，且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[9]。我們通過Western blotting實驗證明，在CD147干擾組細胞中LC3-Ⅱ表達增高，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值增加，CD147抑制了饑餓誘導(dǎo)的前列腺癌細胞自噬。本實驗通過臺盼藍排斥實驗檢測了細胞死亡情況，結(jié)果表明抑制CD1)47的表達后，在饑餓誘導(dǎo)的自噬模型中細胞死亡數(shù)量增加。綜上所述， CD147抑制自噬的產(chǎn)生，防止過度自噬導(dǎo)致的腫瘤細胞死亡，對腫瘤細胞具有保護作用。

[1] Kuang YH, Chen X, Su J, et al. RNA interference targeting the CD147 induces apoptosis of multi-drug resistant cancer cells related to XIAP depletion[J]. Cancer Lett, 2009, 276(2):189-195.

[2] Dai JY, Dou KF, Wang CH, et al. The interaction of HAb18G/CD147 with integrin α6β1 and its implications for the invasion potential of human hepatoma cells[J]. BMC Cancer, 2009, 9:337.

[3] Chen Y, Zhang H, Gou X, et al. Upregulation of HAb18G/CD147 in activated human umbilical vein endothelial cells enhances the angiogenesis[J]. Cancer Lett, 2009, 278(1): 113-121.

[4] Le Floch R, Chiche J, Marchiq I, et al.CD147 subunit of lactate/H+symorters MCT1 and hypoxia-inducible MCT4 is critical of energetic and growth of glycolytic tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(40):16663-16668.

[5] Gou XC, Ru Q, Zhang HX, et al. HAb18G/CD147 inhibits starvation-induced autophagy in human hepatoma cell SMMC7721 with an involvement of beclin 1 down-regulation[J]. Cancer Sci, 2009, 100(5):837-843.

[6] 陳艷媛，廖慧娟，張 靈，等. RNA干擾CD147穩(wěn)定表達前列腺癌PC-3細胞株的建立[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報, 2012, 36(6):404-406.

[7] Martinet W, De Meyer GR, Herman AG, et al. Amino acid deprivation induces both apoptosis and autophagy in murine C2C12 muscle cells[J]. Biotechnol Lett, 2005， 27(16):1157-1163.

[8] 杜海磊，邱偉華，楊衛(wèi)平. 細胞自噬與腫瘤[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):401-404.

[9] 王 煥，李小毛，劉穗玲，等. RAD001通過誘導(dǎo)自噬提高人子宮內(nèi)膜癌細胞對紫杉醇的敏感性[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(11):1966-1971.

CD147 affects autophagy of prostate cancer PC-3 cells

FANG Fang1, FENG Chun1, YAO Yang1, MA Xiao-xiao1, WANG Li-guo2

(1ImmunologyDepartmentofJilinMedicalCollege,Jilin132013,China;2AffiliatedHospitalofJilinMedicalCollege,Jilin132011,China.E-mail:urolancet@sina.com)

AIM: To study the autophagy of prostate cancer PC-3 cells induced by CD147invitro. ME-THODS: The method of amino acid starvation to induce autophagy was used. The expression ofCD147 was detected by Western blotting. To study the functional effects of CD147 on autophagy in prostate cancer PC-3 cells, the down-regulation ofCD147 expression was induced by the technique of RNAi. The conversion of autophagic marker protein LC3-I to LC3-II was determined by Western blotting. The cell death after starvation-induced autophagy was analyzed by trypan blue exclusion assay. RESULTS: The CD147 expression gradually increased in starvation-induced autophagy. The down-regulation of CD147 significantly increased the expression of autophagy-related protein LC3-II compared with control group. Meanwhile, the cell death rates increased from (19.3±3.1)% and (22.3±3.5)% in control groups to (38.4±3.1)% in silencing the expression ofCD147 in the PC-3 cells (P<0.05). CONCLUSION: CD147 inhibits starvation-induced autophgy and autophagy death in the prostate cancer PC-3 cells.

Antigens, CD147; PC-3 cells; Autophagy

1000- 4718(2014)12- 2259- 03

2014- 06- 09

2014- 07- 04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81202031)；吉林省教育廳“十二五”教育技術(shù)研究項目(吉教科合字2012第333號)；吉林省科技廳科技發(fā)展計劃(No.20130101154JC)；吉林省自然科學(xué)基金資助項目(No.201015239)吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究重點項目(No.吉教科合字2013第346號)

R737.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.025

△ 通訊作者 Tel: 0432-64560741； E-mail: urolancet@sina.com