祝 斌， 張寒仙， 曾今誠， 安博然， 徐軍發(fā) ， 舒建昌△

(1暨南大學第一臨床醫(yī)學院， 廣東 廣州 510632； 2廣東醫(yī)學院檢驗醫(yī)學研究所，廣東 東莞 524808；3廣東醫(yī)學院，廣東 湛江 524023； 4廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 524808)

美沙拉嗪對DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型Th1、Th17及Treg細胞亞群的影響*

祝 斌1， 張寒仙2,3， 曾今誠2,4， 安博然3， 徐軍發(fā)2,4， 舒建昌1△

(1暨南大學第一臨床醫(yī)學院， 廣東 廣州 510632；2廣東醫(yī)學院檢驗醫(yī)學研究所，廣東 東莞 524808；3廣東醫(yī)學院，廣東 湛江 524023；4廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 524808)

目的： 觀察葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠潰瘍性結腸炎(UC)模型中輔助性T細胞(Th1、Th17亞群)及調節(jié)性T細胞(Treg)細胞亞群的變化，探討美沙拉嗪(MSLZ)治療UC的免疫學機制。方法: 采用流式細胞分析術檢測DSS誘導的小鼠UC模型結腸組織及外周血單個核細胞中白細胞介素17(IL-17)、γ-干擾素(IFN-γ)及核轉錄因子Foxp3的表達，并檢測MSLZ預治療對小鼠UC 模型Th1、Th17和Treg亞群的影響。結果: 在DSS誘導的小鼠UC模型中，其外周血單個核細胞(PBMC)中CD3+T細胞高表達IL-17、IFN-γ及Foxp3，腸黏膜單個核細胞(LPMC)中CD3+T細胞高表達IFN-γ和Foxp3，但IL-17的表達與對照組無差異。進一步發(fā)現(xiàn)UC模型小鼠LPMC中Th17、Th1和Treg均顯著高于對照組，但PBMC中只有Treg高于對照組。MSLZ預治療能顯著下調UC 模型小鼠PBMC和LPMC中Th17、Th1和Treg細胞亞群。結論: DSS誘導的小鼠 UC模型中CD4+T細胞亞群Th1、Th17及Treg細胞顯著升高，提示CD4+T細胞亞群在UC發(fā)病中起重要作用，美沙拉嗪可能通過調節(jié)Th1、Th17及Treg細胞亞群發(fā)揮抗炎及治療UC作用。

葡聚糖硫酸鈉； 潰瘍性結腸炎； 美沙拉嗪

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是炎癥性腸病的一種，是一類病因不明的以胃腸道慢性非特異性炎癥為主要表現(xiàn)的疾病，近年來成為消化系統(tǒng)常見的疾病，其主要臨床表現(xiàn)為腹痛與腹瀉[1]。關于其病因目前大多數(shù)研究認為與環(huán)境、遺傳、感染及免疫學因素相關，而免疫學因素被認為與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關，CD4+T細胞亞群在UC發(fā)病中尤為重要[2]。本研究通過檢測葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的小鼠UC模型結腸組織及外周血單個核細胞中CD4+T細胞胞內IL-17、IFN-γ和核轉錄因子Foxp3的表達，觀察UC小鼠模型CD4+T細胞亞群的改變，并研究美沙拉嗪(mesalazine，MSLZ)預治療對各CD4+T細胞亞群的影響，探討UC可能的發(fā)病機制及美沙拉嗪治療UC的免疫學機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

無病原環(huán)境出生的C57BL/6小鼠(6～8周齡)(購自廣東省實驗動物中心)。DSS分子量為35 000～40 000，購自MP?？剐∈驝D3-PE-Cy7(BioLegend)；抗小鼠CD4- FITC、抗小鼠CD272-APC、抗小鼠 IL-17- PE、抗小鼠 IFN-γ PerCP-Cy5.5和抗小鼠 Foxp3 -PE-Cy5.5均購自eBioscience。流式細胞儀為BD 產(chǎn)品。破膜劑為杭州聯(lián)科生物公司產(chǎn)品。美沙拉嗪為葵花藥業(yè)產(chǎn)品。大便隱血試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。膠原酶II為Sigma產(chǎn)品。

2 UC模型制作與觀察

參閱文獻[3-4]制作UC模型，取小鼠16只，隨機分為對照組(Con組)和實驗組(DSS組)，每組8只小鼠，2組小鼠性別比、周齡、健康狀況及體重均無統(tǒng)計學差異，可進行后續(xù)實驗。Con組小鼠給予自來水自由飲用，DSS組給予5% DSS(用水溶解)自由飲用，各組小鼠實驗時間為7 d，第8天處死小鼠。造模后每天觀察小鼠活動情況、毛色變化、大便性狀、顏色及有無出血等情況。

3 美沙拉嗪干預治療

取小鼠8只，給予5% DSS造模，在造模的同時給予美沙拉嗪治療，作為美沙拉嗪治療組(MSLZ組)，每天用美沙拉嗪(緩釋顆粒;商品名：艾迪莎)灌胃治療，按實驗動物與人體表面積比等效劑量換算比率，將每天劑量折算成小鼠等效劑量作為中劑量用量[小鼠用量(g/kg)=人每天口服藥量(g)×0.0026/0.02kg]，時間為7 d，同樣每天觀察小鼠活動情況、毛色變化、大便性狀、顏色及有無出血等情況。

4 外周血單個核細胞分離

第8天取小鼠內眥靜脈血，用EDTA-K2抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，對細胞進行活性檢測和計數(shù)后重懸于含2% 胎牛血清的PBS中，備用。

5 結腸黏膜固有層單個核細胞分離

小鼠結腸黏膜固有層單個核細胞(lamina propria mononuclear cells，LPMC)的分離參閱文獻[5]方法進行。取小鼠肛門至盲腸末端結腸，縱切，去內容物，將組織剪碎足夠小，于含EDTA和二硫蘇糖醇(dithi othreitol, DTT)的PBS液中孵育30 min，離心，重復2次。將組織置于酶液(膠原酶II 含量為0.5 g/L的RPMI-1640)中，37℃水浴消化30 min，離心，過濾，收集濾液，回收濾渣重復消化1次，收集所有濾液加入到含有小鼠淋巴細胞分離液的離心管中離心，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個核細胞，2% FBS-PBS洗滌，對細胞進行活性檢測和計數(shù)后重懸于含2%胎牛血清的PBS中，備用。

6 流式細胞術檢測T細胞亞群胞內細胞因子

將分離的單個核細胞分成4份，每份細胞數(shù)為1×106，加PMA/Iono Mixture 體外37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，最后2 h加BFA孵育，洗滌，1份加同型對照抗體，其余3份分別加入CD3-PE-Cy7/CD4-FITC混合抗體和CD3-PE-Cy7/CD8-PE混合抗體，避光孵育25 min，PBS洗滌，加破膜劑A 液100 μL避光孵育15 min，PBS洗滌，加破膜劑B液100μL，同時分別加入IL-17-PE/IFN-γ-PerCp-Cy5.5混合抗體、Foxp3-PE-Cy5.5和IFN-γ-PerCp-Cy5.5，避光孵育25 min，洗滌，固定，上流式細胞儀分析。

7 病理組織分級標準

0級：黏膜固有層無中性粒細胞浸潤；Ⅰ級：固有層有少量中性粒細胞浸潤(<10 cells/HPF)，并累及部分隱窩；Ⅱ級：固有層明顯中性粒細胞浸潤(10～50 cells/HPF)，累及50%以上隱窩；Ⅲ級：固有層大量中性粒細胞浸潤(>50 cells/HPF)，同時伴有隱窩膿腫；Ⅳ級：固有層明顯急性炎癥伴有潰瘍形成。

8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 成功建立了小鼠UC模型

DSS誘導的模型組小鼠第4天開始體重出現(xiàn)下降，到第7天體重下降超過15%，MSLZ組小鼠體重自第5天開始出現(xiàn)體重下降，體重下降不超過5%，而對照組體重無明顯降低；第4天出現(xiàn)血便，對照組小鼠大便隱血均為陰性，MSLZ組小鼠有2只第5天大便隱血試驗陽性；DSS組小鼠7 d內無死亡，MSLZ灌胃治療組無死亡情況；腸道組織HE染色顯示DSS組結腸陷窩消失、腺體減少，大量炎癥細胞浸潤，對照組結腸結構無明顯異常，MSLZ組陷窩、腺體結構清晰，少量炎癥細胞浸潤，見圖1。

各組小鼠病理組織學分級比較：DSS組組織學分級大部分小鼠為Ⅲ級和IV級；MSLZ組0級有5例，Ⅰ級和Ⅱ級分別為2例和1例，無Ⅲ級和Ⅳ級；對照組0級7例，I級1例，見表1。

表1 各組小鼠病理組織學分級比較

Table 1.Comparision of histological grading among the 3 groups (%.n=8)

Group0ⅠⅡⅢⅣCon87.512.5000MSLZ62.525.012.500DSS0025.050.037.5

Figure 1.UC animal model establishment and mesalazine. treatment. A： mice body weight loss curve.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;△P<0.05vsDDS group. B: HE staining of colon tissue of each group.

圖1 建立小鼠UC模型及美沙拉嗪預治療模型

2 UC模型小鼠外周血中IL-17、IFN-γ及Foxp3在CD3+T細胞的表達升高

在DSS誘導的小鼠UC模型中，其外周血單個核細胞中CD3+T細胞高表達IL-17、IFN-γ及Foxp3，腸黏膜單個核細胞中CD3+T細胞高表達IFN-γ和Foxp3，但IL-17的表達與對照組無差異，見圖2。

3 UC模型小鼠腸組織中Th1、Th17和Treg細胞亞群升高

根據(jù)不同CD4+T細胞亞群產(chǎn)生細胞因子的不同，我們進一步分析了UC模型小鼠外周血和腸組織中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)和Treg(CD3+CD4+Foxp3+)細胞亞群的變化，經(jīng)流式細胞術胞內細胞因子檢測結果顯示，DSS組小鼠LPMC中Th1、Th17和Treg細胞亞群較對照組均顯著升高(均P<0.05)；但DSS組小鼠PBMC中只有Treg細胞亞群較對照組升高(P<0.05),見圖3。

Figure 2.Expression of IL-17，IFN-γ and Foxp3 in PBMCs and LPMSs of UC mice. Meam±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

圖2 UC模型小鼠CD3+T細胞IL-17、IFN-γ和Foxp3的表達

Figure 3.Expression of Th1,Th17 and Tregs in PBMCs and LPMCs of UC mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group.

圖3 UC模型小鼠Th1、Th17和Treg細胞亞群的變化

4 美沙拉嗪對UC模型小鼠CD4+T細胞亞群的影響

為了探討美沙拉嗪治療UC的免疫學機制，我們進一步檢測了美沙拉嗪對UC模型小鼠CD4+T細胞亞群的影響，見圖4，我們發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預治療后UC模型小鼠外周血中CD4+Foxp3+T細胞熒光強度較DSS組降低，提示美沙拉嗪能下調UC模型小鼠外周血中Treg細胞中Foxp3的表達。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪能顯著下調UC模型小鼠腸組織中Th1、Th17和Treg亞群。

討 論

潰瘍性結腸炎是一種原因不明的直腸和結腸炎癥，是危害人類健康的慢性疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告[6]，該病發(fā)生率為1/10 000～2/10 000，在我國UC的患病率約為1.16/10 000，實際的病例數(shù)更多。因此，對于UC發(fā)病的研究及治療方法的探討也成為醫(yī)療衛(wèi)生界的重要課題。

以往的研究認為UC的發(fā)生發(fā)展與IL-4、IL-5、IL-13等介導的Th2型免疫反應密切相關[7]，近期研究認為產(chǎn)生IL-17的Th17型細胞[8]、產(chǎn)生IFN-γ的Th1型細胞以及Foxp3+Treg細胞[9]均在UC的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥細胞因子，其具有強大的促炎反應活性，在不同的疾病中發(fā)揮著不同作用。有文獻報道IL-17通過IL-17/IL-23軸參與炎癥性腸病的發(fā)生[10]，研究顯示在炎癥性腸病患者中IL-17的產(chǎn)生較正常人明顯增加，這在小鼠潰瘍性結腸炎模型中也得到了證實。IFN-γ是Th1細胞亞群產(chǎn)生的主要細胞因子，這類細胞因子在疾病中的研究及其作用機制都比較明確，在UC發(fā)病中IFN-γ起重要作用，本研究結果顯示：盡管UC小鼠模型外周血中Th17和Th1細胞與對照組無顯著差異，但在腸組織中產(chǎn)生Th17和Th1細胞亞群均顯著增高，說明Th17和Th1細胞在UC腸道局部炎癥損傷中起重要作用。

調節(jié)性T細胞是一組具有免疫負調節(jié)作用的T細胞亞群，它在維持機體免疫平衡、形成外周免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。Treg細胞可在體外通過細胞接觸依賴機制參與炎癥反應，另外Treg細胞表達高水平的細胞毒T淋巴細胞相關抗原4與抗原提呈細胞上的B7結合，誘導色氨酸裂解酶-吲哚胺2,3-二加氧酶活化，介導免疫耐受[11]。同時Treg細胞還可通過調節(jié)釋放抑制性細胞因子(IL-10等)參與UC的發(fā)病，其數(shù)量較少或者功能異常均可導致疾病的發(fā)生。王曉紅等[12]在研究大黃、巴豆霜對三硝基苯磺酸誘導的UC大鼠模型中發(fā)現(xiàn)在模型組大鼠外周血Treg細胞的百分比顯著降低；周紅光等[13]在對三硝基苯磺酸誘導的UC大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)其模型組外周血及腸系膜淋巴結中CD4+CD25+Treg細胞顯著降低；Chao 等[14]在UC患者中發(fā)現(xiàn)Treg細胞比例低于健康人；譚至柔等[15]在UC患者外周血中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。另外在T細胞缺乏的小鼠體內輸注CD45RBhighCD4+T細胞可誘導形成炎癥性腸病模型，同時可以調節(jié)Th1型T細胞產(chǎn)生IFN-γ的效應，這證實了Treg細胞減少或功能異常均可導致UC的發(fā)病。但是也有部分研究認為Treg細胞在炎癥狀態(tài)下代償性增加，與Th17細胞亞群呈現(xiàn)協(xié)同狀態(tài)，參與炎癥反應。有報道[11]在活動性潰瘍性結腸炎患者外周血中Treg細胞明顯高于健康人，且活動性潰瘍性結腸炎比慢性潰瘍性結腸炎外周血Treg細胞升高。另外也有研究證實[8]在小兒UC和克羅恩病中，Treg細胞數(shù)量較正常人升高，Rismo等[16]在UC成年患者中也證實了這點。本組實驗研究發(fā)現(xiàn)在外周血Treg細胞和病變局部腸道組織中Treg細胞水平均較正常對照組升高，這可能與小鼠體內環(huán)境不同，炎癥細胞因子數(shù)量優(yōu)勢不同相關，在炎癥狀態(tài)下大量淋巴細胞浸潤，調節(jié)性T細胞也代償性增加，但是其增加水平無法抗衡促炎因子增加水平，從而發(fā)生炎癥反應。同時這也提示在潰瘍性結腸炎小鼠中，由于Treg細胞的異常，可能導致機體免疫失衡，從而使效應性CD4+T細胞從循環(huán)系統(tǒng)向腸道局部炎癥部位移行，富集于炎癥損傷部位，從而導致消化道黏膜處于高度活化狀態(tài)，誘發(fā)機體腸道免疫反應，從而導致對自身抗原不耐受，損傷性細胞因子釋放增加，導致黏膜損傷。因此，我們認為Treg細胞失衡在潰瘍性結腸炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。這與郭敏等[17]在大鼠模型中的研究報道一致。另外國外有文獻報道[18]在UC患者外周血、結腸組織及腸系膜淋巴結等檢測發(fā)現(xiàn)其Treg細胞較正常人升高，其可能的機制是結腸組織或腸系膜淋巴結組織中增加的Treg細胞在體內可能通過某些共刺激分子或Toll樣受體信號途徑其抑制效應T細胞的功能被抑制，因此，即使在體外實驗發(fā)現(xiàn)其外周血和病變組織中Treg細胞升高，這種升高仍不能逆轉疾病的發(fā)生及發(fā)展，其具體機制目前暫未明確[19]。因此，我們認為在UC小鼠外周血和病變結腸組織中升高的Treg可能在不同程度上限制疾病的發(fā)展，但是不能逆轉疾病的發(fā)生。

Figure 4.Efflect of MSLZ on CD4+T cell subsets in UC mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,vsCon group;△P<0.05 vs, MSLZ group.

圖4 美沙拉嗪對UC模型小鼠CD4+T細胞亞群的影響

美沙拉嗪是一種新型5-氨基水楊酸控釋劑，是治療潰瘍性結腸炎的首選藥物之一，特別適用于對柳氮磺吡啶不能耐受的患者的急性發(fā)作。本組實驗采用美沙拉嗪微膠顆粒予小鼠灌胃，結合文獻報道[20]采用中劑量用量預治療小鼠潰瘍性結腸炎能有效減輕小鼠腸道炎癥，因此本組實驗選用中劑量灌胃治療。結果發(fā)現(xiàn)，采用美沙拉嗪治療小鼠7d后結腸組織炎癥滲出較少，隱窩及腺體結構清晰，炎癥程度較DSS誘導的UC小鼠組輕，其臨床療效顯著。因此，我們認為美沙拉嗪灌胃預治療能有效降低腸道炎癥。而其作用的機制暫未完全明確，有研究認為其主要是通過作用于腸道炎癥黏膜，抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎癥介質白三烯的形成，清除氧自由基，抑制腸黏膜的脂肪酸氧化，降低腸上皮通透性，從而對腸道壁炎癥起顯著的消炎作用，對發(fā)炎的腸壁結締組織效果尤佳[21]。其免疫學機制研究較少，有報道[22]認為其可能通過抑制結腸組織下調NF-κB的表達，減少結腸局部炎性細胞因子的產(chǎn)生，最終達到治療潰瘍性結腸炎的目的；也可能通過影響其它細胞因子或信號轉導途徑發(fā)揮抗炎作用[23- 24]，然而美沙拉嗪對T細胞亞群的研究較少，且機制暫未明確。本組實驗研究發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預治療后UC小鼠炎癥減輕，且預治療組小鼠外周血分泌IFN-γ的Th1細胞活性降低，這提示美沙拉嗪可能調節(jié)Th1細胞活性。有研究顯示[25]美沙拉嗪釋放一氧化氮衍生物NCX-456，而這種NCX-456可抑制Th1細胞誘導的細胞因子的釋放，同時促進抑炎因子的產(chǎn)生，在UC中發(fā)揮重要的抗炎作用，且NCX-456能抑制細胞增殖，導致活化的腸黏膜固有層Th1細胞選擇性凋亡，從而達到抗炎作用，但是其具體誘導Th1細胞的調節(jié)機制及途徑還有待進一步明確。另外本實驗研究顯示美沙拉嗪預治療后下調了外周血產(chǎn)生IL-17的Th17細胞活性，但是對組織中Th17的活性無影響。Th17細胞活化可誘導NF-κB信號途徑活化，從而產(chǎn)生誘導型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶2等，同時產(chǎn)生大量IL-17介導促炎反應，美沙拉嗪預治療UC下調Th17細胞的活性，從而阻斷或減弱NF-κB信號途徑，降低促炎因子的分泌，從而達到減輕炎癥反應的目的[26]。本組實驗美沙拉嗪可降低外周血Th17水平，而局部炎癥部位Th17細胞呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，這可能與局部炎癥嚴重，短時間內美沙拉嗪不能快速影響Th17細胞的功能有關，這也提示在急性炎癥嚴重時治療周期及治療劑量可能需要根據(jù)病情適當調整。同時，本組實驗研究發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預治療能降低外周血及病變組織中Treg細胞活性，但是其水平仍然較對照組升高，這提示美沙拉嗪可能誘導Treg細胞參與其對疾病的治療。在炎癥早期誘導Treg細胞產(chǎn)生，但是炎癥緩解后Treg細胞活性迅速下降，這與Requena 等[26]的報道一致。但是其具體調節(jié)機制還有待進一步明確。

綜上所述，我們在DSS誘導小鼠UC模型中發(fā)現(xiàn)效應性CD4+T細胞亞群Th17、Th1和調節(jié)性CD4+T細胞亞群都升高，尤其是Treg的代償性升高可能在UC發(fā)病中起重要作用，美沙拉嗪可能通過調節(jié)Th1、Th17和Treg細胞亞群的功能從而發(fā)揮抗炎作用。

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Effect of mesalazine on Th1, Th17 and Treg cells in mice with DSS-induced ulcerative colitis

ZHU Bin1, ZHANG Han-xian2, 3, ZENG Jin-cheng2, 4, AN Bo-ran3, XU Jun-fa2, 4, SHU Jian-chang1

(1FirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2InstituteofLaboratoryMedicine,GuangdongMedicalCollege,Dongguan524808,China;3GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;4GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnostics,Dongguan524808,China.E-mail:shujc62@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of mesalazine treatment on regulation of Th1, Th17 and Treg cells in mice with dextran sulfate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis (UC). METHODS: The expression of IL-17, IFN-gamma and Foxp3 in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and intestinal mucosa lamina propria mononuclear cells (LPMC) of DSS-induced UC mice was detected by flow cytometry analysis. The effect of mesalazine treatment on regulaiton of Th1, Th17 and Treg cells in the mice with DSS-induced ulcerative colitis was examined.RESULTS: The expression of IL-17, IFN-γ and Foxp3 on CD4+T cells were significantly higher in the PBMC of DSS-induced mice than those in control group. CD4+IFN-γ+T cells and CD4+Foxp3+T cells were higher in LPMC than those in control group, except CD4+IL-17+T cells. Moreover, the Th1, Th17 and Treg cells were higher in DSS group than those in control group in LPMC. However, only Tregs was higher in PBMC. Pre-treatment with mesalazine significantly decreased the number of Th17, Th1 and Treg cells of UC model mice both in PBMC and LPMC.CONCLUSION: The Th1, Th17 and Tregs cells in DSS-induced mice were significantly higher than those in control mice, suggesting that CD4+T cell subsets play an important role in the pathogenesis of UC. Mesalazine may play a role in the treatment of UC by regulating the Th1, Th17 and Tregs cells.

Dextran sulfate sodium; Colitis, ulcerative; Mesalazine

1000- 4718(2014)12- 2219- 07

2014- 01- 27

2014- 09- 12

國家自然科學基金資助項目(No.81273237; No.30972779)；廣東省科技計劃項目(No. 2011B061300098)

R574.62

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.018

△通訊作者 Tel: 020-34403830; E-mail: shujc62@hotmail.com