吳惠玲

(淄博市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 淄博 255200)

小檗堿對胰島β細胞的保護作用及其機制研究

吳惠玲△

(淄博市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 淄博 255200)

目的： 探討小檗堿對胰島β細胞的保護作用及可能機制。方法: 采用四氧嘧啶(Axn)誘導INS-1胰島β細胞損傷模型，并以不同濃度的硫酸小檗堿進行干預。將細胞分為對照組(Con組)、損傷組(Axn組)、低劑量小檗堿組(LBer組，小檗堿濃度為15 μmol/L)、中劑量小檗堿組(MBer組，小檗堿濃度為45 μmol/L)及高劑量小檗堿組(HBer組，小檗堿濃度為100 μmol/L)。流式細胞術觀察各組細胞凋亡情況，Western blotting免疫印跡法分別觀察各組PTEN/PI3K/Akt信號通路、HNF-1α/PDX-1信號通路活化情況以及激活型caspase-3的水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)觀察各組基礎胰島素釋放及葡萄糖刺激后胰島素的釋放水平。結果: 與Con組相比，Axn組凋亡率顯著升高，但小檗堿干預后凋亡水平顯著降低，且呈濃度依賴性。與Con組相比，Axn組PTEN表達水平明顯升高，而PI3K/Akt活性被抑制，激活型caspase-3水平顯著升高；而小檗堿處理則能逆轉上述PTEN通路的促凋亡作用，且顯示出濃度依賴性；與Con組相比，Axn組HNF-1α/PDX-1信號通路活性顯著下降，但小檗堿處理則能提高該通路活性，表現(xiàn)出濃度依賴性。與Con組相比，Axn組基礎及葡萄糖刺激下胰島素釋放水平均顯著降低，而小檗堿處理則能顯著恢復上述胰島素釋放水平，呈濃度依賴性。結論: 小檗堿對四氧嘧啶損傷的INS-1胰島β細胞具有保護作用，表現(xiàn)為對其凋亡的抑制與胰島素分泌功能的恢復，分別與影響細胞內(nèi)PTEN/PI3K/Akt及HNF-1α/PDX-1信號通路有關。

小檗堿； β細胞； 細胞凋亡； 胰島素

在世界范圍內(nèi)，糖尿病(diabetes mellitus, DM)是發(fā)病率僅次于心血管疾病及腫瘤的第三大非傳染性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，2010年時全球共有2.58億糖尿病患者，2012年該數(shù)字上升至3.71億，預計到2030年，全球?qū)?.39億糖尿病患者[1]。作為一種慢性進展性代謝紊亂性疾病，糖尿病的致死及致殘率極高，在所有疾病中是僅次于感染性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤以及創(chuàng)傷性疾病的第五大致死性病因。糖尿病系各種原因?qū)е碌囊葝uβ細胞損傷及功能障礙引起的胰島素分泌水平下降引起，因此如何防治β細胞損傷并恢復其正常功能成為糖尿病治療的關鍵環(huán)節(jié)。小檗堿(berberine, Ber)是一種異喹啉類生物堿，主要存在于中藥黃連(CoptischinensisFranch.)以及云連(CoptisteetaWall.)等的根莖中[2]。近年來的研究表明小檗堿具有多種生物學活性，如抗炎、抗氧化以及抗增殖等，可影響多種細胞內(nèi)信號轉導通路的活性。目前認為，小檗堿對糖尿病具有一定的治療作用，但具體機制尚未研究清楚。本研究以四氧嘧啶誘導體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細胞株INS-1損傷模型，用小檗堿干預后觀察其對β細胞的保護作用并對其可能機制進行探討，為小檗堿在糖尿病中的治療價值提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

大鼠胰島素分泌β細胞株INS-1購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；硫酸Ber、四氧嘧啶(alloxan，Axn)和噻唑藍(MTT)購自Sigma；Annexin V-FITC流式凋亡檢測試劑盒購自BD；第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin ho-molog on chromosome ten，PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinsitol 3-kinase,PI3K)、肝臟細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1a,HNF-1α)以及胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)抗體均購自Abcam；蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)以及磷酸化的Akt(p-Akt)抗體均購自CST；激活型caspase-3(cleaved caspase-3)以及GAPDH抗體購自Santa Cruz；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自R&D。

2 細胞培養(yǎng)、處理及分組

INS-1細胞接種于含有10%胎牛血清(Gibco)以及青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中，在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，視細胞生長情況每2～3 d進行一次換液，細胞貼壁生長占培養(yǎng)瓶瓶壁的90%左右時，可以1∶2～1∶3的比例進行傳代及分瓶培養(yǎng)。

將1×109/L的INS-1細胞懸液分為對照組(Con)、損傷組(Axn)、小檗堿低劑量組(LBer)、小檗堿中劑量組(MBer)以及小檗堿高劑量組(HBer)。Con組進行常規(guī)培養(yǎng)；Axn組培養(yǎng)基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶；LBer組培養(yǎng)基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為15 μmol/L的硫酸小檗堿溶液；MBer組培養(yǎng)基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為45 μmol/L的硫酸小檗堿溶液；HBer組培養(yǎng)基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為100 μmol/L的硫酸小檗堿溶液。上述各組細胞均在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養(yǎng)環(huán)境下進行72 h的培養(yǎng)。

3 主要實驗方法

3.1 MTT比色法測定細胞抑制率 稱取0.5 g MTT，溶于100 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中制成濃度為5 g/L的MTT溶液。將上述各組細胞懸液各200 μL接種于96孔板中，每組設6個復孔并設置調(diào)零孔及對照孔。在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養(yǎng)環(huán)境下進行72 h的培養(yǎng)。向每孔中加入20 μL上述MTT溶液并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔中培養(yǎng)液終止培養(yǎng)并向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速搖床上充分振蕩10 min后在680型酶標儀(Bio-Rad)上讀取490 nm處的吸光度(A)值。細胞抑制率為存活細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

3.2 Annexin V-PI雙染流式細胞術凋亡檢測 以胰酶在培養(yǎng)皿中對上述各組貼壁細胞進行消化，完全培養(yǎng)液終止消化后以1 000 r/min在室溫下離心5 min后棄去上清液，使用預冷的PBS充分洗滌并將各組細胞收集入EP管中。向各管中加入試劑盒中的binding buffer并將細胞懸液濃度調(diào)整為1×109/L。分別向各管中加入5 μL的Annexin V并在避光條件下室溫反應10 min，向各管中加入5 μL的PI并在避光條件下室溫反應5 min。再向各管中加入300 μL的binding buffer后將等量細胞轉移入Falcon管在FACScan流式細胞儀(BD)上對細胞凋亡進行檢測。

3.3 細胞胰島素釋放的檢測 將上述各組培養(yǎng)皿中細胞培養(yǎng)液棄去，以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2～3次，加入KRB緩沖液(葡萄糖濃度2.8 mmol/L)培養(yǎng)2 h后收集上清；再向各組培養(yǎng)體系中加入KRB緩沖液(葡萄糖濃度16.7 mmol/L)培養(yǎng)2 h后收集上清。ELISA法對收集的各組上清液中胰島素含量進行檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，最后在680型酶標儀上讀取450 nm的A值，并根據(jù)標準曲線對胰島素濃度進行計算。

3.4 Western blotting蛋白免疫印跡實驗 將上述各組培養(yǎng)皿中細胞培養(yǎng)液棄去，以預冷的PBS洗滌2～3次后收集各組細胞，以RIPA裂解液(ProMab)進行裂解，并加入終濃度為1 mmol/L的PMSF(Santa Cruz)。4 ℃下以12 500 ×g離心10 min獲得的上清即為總蛋白。采用BCA法對上述蛋白濃度進行檢測。將各組20 μg總蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行垂直電泳后電轉印至PVDF膜。5%脫脂牛奶TBST溶液室溫下封閉90 min后，分別使用PTEN(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、HNF-1α(1∶1 000)、PDX-1(1∶2 000)以及GAPDH(1∶500)抗體孵育，洗滌后再以辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗(1∶2 000)進行孵育。TBST洗滌后以增強型ECL發(fā)光試劑盒對免疫印跡進行檢測與觀察。

4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 小檗堿對損傷胰島β細胞抑制率的影響

經(jīng)MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與Con組比，四氧嘧啶處理的胰島β細胞抑制率顯著升高；而小檗堿處理則能隨小檗堿濃度的升高顯著降低細胞抑制率，見圖1。

Figure 1.Comparison of the inhibitory rates among different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;##P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖1 各組細胞抑制率的比較

2 小檗堿對損傷胰島β細胞凋亡的影響

經(jīng)Annexin V-PI雙染流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，四氧嘧啶處理能夠顯著促進INS-1細胞凋亡；而在小檗堿處理后，細胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而呈現(xiàn)顯著降低,見圖2。

Figure 2.Comparison of the apoptotic rates among different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;##P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖2 各組細胞凋亡率的比較

3 小檗堿對損傷胰島β細胞PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響

Western blotting法發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，Axn組PTEN表達水平顯著升高，PI3K表達水平及Akt磷酸化水平則顯著降低；而與Axn組相比，小檗堿處理的LBer、MBer及HBer組，PTEN表達水平隨著濃度升高而下降，同時PI3K表達水平及Akt磷酸化水平則顯著升高,見圖3。

4 小檗堿對損傷胰島β細胞cleaved caspase-3水平的影響

與Con組相比，Axn組cleaved caspase-3水平顯著升高；而與Axn組相比，LBer、Mber以及HBer組cleaved caspase-3水平則明顯降低，且呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性,見圖4。

Figure 3.Comparison of PTEN/PI3K/Akt pathway activation among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖3 各組細胞PTEN/PI3K/Akt通路活化情況的比較

5 小檗堿對損傷胰島β細胞胰島素分泌水平的影響

在四氧嘧啶的作用下，Axn組的基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激胰島素釋放量均較Con組顯著降低，而接受小檗堿處理的LBer、MBer及HBer組的基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激胰島素釋放量均較Axn組顯著改善，且呈明顯的濃度依賴性,見表1。

6 小檗堿對損傷胰島β細胞HNF-1α/PDX-1信號通路的影響

如圖5所示，與Con組相比，Axn組的HNF-1α及PDX-1表達均顯著下調(diào)；而與Axn組相比，LBer、MBer以及HBer組的HNF-1α及PDX-1表達均顯著增加，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

討 論

隨著社會與經(jīng)濟的發(fā)展，現(xiàn)代社會營養(yǎng)過剩及運動減少等生活方式的轉變，發(fā)達國家及發(fā)展中國家人群糖尿病發(fā)病率均呈現(xiàn)逐年顯著升高的趨勢。糖尿病的并發(fā)癥，包括糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及糖尿病周圍神經(jīng)病變等極大程度地降低患者生活質(zhì)量甚至威脅患者的生命。作為一種多病因的代謝紊亂性疾病，雖然發(fā)病機制復雜，但胰島β細胞絕對數(shù)量減少及分泌胰島素功能障礙是導致糖尿病發(fā)病的根本原因。胰島細胞代謝旺盛，相比于機體內(nèi)其它組織細胞，β細胞對外界不良刺激的易感性更強。四氧嘧啶能夠?qū)Ζ录毎a(chǎn)生特異性的細胞毒性，通過產(chǎn)生自由基等造成β細胞損傷[3]。本研究采用四氧嘧啶制作胰島β細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)β細胞凋亡增多，且其胰島素分泌功能下降，與既往研究相符。

Figure 4.Comparison of the cleaved caspase-3 levels among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖4 各組激活型caspase-3水平的比較

表1 各組基礎及葡萄糖刺激胰島素釋放量的比較

Table 1.The basal insulin release and stimulated insulin release in different groups (Mean±SD.n=3)

GroupBasalinsulinrelease(mIU/L)Stimulatedinsulinrelease(mIU/L)Con2.25±0.314.86±0.17Axn0.89±0.10*1.14±0.09*LBer1.28±0.21#1.87±0.10#MBer1.79±0.20#△2.33±0.08#△HBer2.04±0.24#△▲3.27±0.11#△▲

*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿在包括細菌/病毒感染、血脂紊亂、炎癥、惡性腫瘤、骨質(zhì)疏松以及糖尿病等多種疾病中均具有顯著的治療作用。在我國傳統(tǒng)中醫(yī)中，糖尿病又被稱為消渴癥，而早在我國古代魏晉時期就已經(jīng)有用中藥黃連治療消渴癥的記載[4]。近年來的研究表明，小檗堿在治療糖尿病時具有類似磺脲類藥物的降血糖藥理活性[5]，但其機制尚未研究清楚。PTEN是上世紀90年代在腫瘤細胞內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)的一種抑癌因子，隨后的研究表明其還在細胞生長、分化、凋亡、遷移及胚胎發(fā)育中扮演重要的角色。PI3K是PTEN下游的作用底物分子之一，PTEN以其PI3K酶活性抑制PI3K的作用，從而使PI3K下游的Akt分子磷酸化程度降低，上述3個分子構成PTEN/PI3K/Akt信號通路。PTEN表達增高后可抑制PI3K/Akt的活性而促進細胞凋亡，此時caspase瀑布級聯(lián)反應被激活[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在四氧嘧啶作用后，INS-1細胞內(nèi)PTEN表達升高，而PI3K/Akt信號則被抑制，同時激活型caspase-3水平增高，INS-1細胞凋亡率升高。而在小檗堿干預后，隨著藥物濃度的提高，INS-1細胞內(nèi)PTEN表達水平降低，PI3K/Akt信號被激活，細胞凋亡率顯著降低，表現(xiàn)為細胞內(nèi)激活型caspase-3水平下降。上述結果表明小檗堿能夠通過影響PTEN/PI3K/Akt信號通路對四氧嘧啶誘導的INS-1胰島細胞凋亡起保護作用。

Figure 5.Comparison of HNF-1α/PDX-1 pathway activation among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group; △P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖5 各組HNF-1α/PDX-1信號通路活化情況的比較

如前所述，除了胰島β細胞凋亡，糖尿病時β細胞分泌胰島素功能也出現(xiàn)障礙。在INS-1胰島素分泌實驗中發(fā)現(xiàn)，四氧嘧啶導致的細胞損傷使INS-1基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激下胰島素釋放量均顯著降低。而使用小檗堿處理細胞后，隨著小檗堿藥物濃度的不斷升高，INS-1細胞基礎及葡萄糖刺激下的胰島素釋放量均顯著升高。本研究結果初步顯示這一作用機制與小檗堿對HNF-1α/PDX-1信號通路的激活作用有關。除了在脂肪酸代謝調(diào)節(jié)中的關鍵作用，HNF-1α基因表達的缺失被認為參與了胰島β細胞胰島素分泌障礙的發(fā)生，因而與糖尿病發(fā)病有關。因其直接參與啟動胰島素的轉錄與合成過程，PDX-1是經(jīng)典的胰島β細胞胰島素分泌功能的分子標記物[7]。近期的數(shù)項研究均表明，PDX-1是HNF-1α的下游分子，后者能夠通過與PDX-1基因啟動區(qū)直接作用而促進PDX-1的分泌[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在四氧嘧啶損傷的INS-1細胞中，HNF-1α/PDX-1信號通路被顯著抑制，而在小檗堿作用后，INS-1細胞HNF-1α/PDX-1信號通路出現(xiàn)顯著的激活狀態(tài)，最終表現(xiàn)為胰島β細胞胰島素分泌功能的恢復。

綜上所述，小檗堿對四氧嘧啶損傷的INS-1胰島β細胞具有保護作用，表現(xiàn)為對其凋亡的抑制與胰島素分泌功能的恢復，分別與影響細胞內(nèi)PTEN/PI3K/Akt及HNF-1α/PDX-1信號通路有關。

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Protective effects of berberine in pancreatic islet beta cells

WU Hui-ling

(DepartmentofEndocrinology,FirstHospitalofZiboCity,Zibo255200,China.E-mail:axemaxme@sina.com)

AIM: To explore the protective effects of berberine (Ber) on islet beta cells and related possible mechanisms. METHODS: The injury of INS-1 cells was induced by treatment with alloxan (Axn). Berverine was then given at serial concentrations. The cells were divided into control group (Con), injury group (Axn), low-dose berberine group (LBer), medium-dose berberine group (MBer) and high-dose berberine group (HBer). Flow cytometry was employed to detect the apoptosis. The activation of PTEN/PI3K/Akt and HNF-1α/PDX-1 pathways and the protein level of cleaved caspase-3 were evaluated by Western blotting. The insulin releases under normal or high-glucose stimulation were measured by ELISA. RESULTS: Compared with Con group, the apoptotic rate increased significantly in Axn group. Berberine treatment reduced the apoptotic rate in LBer group, MBer group and HBer group in a concentration-dependent manner. Compared with Con group, the protein levels of PTEN and cleaved caspase-3 increased, while PI3K and phosphorylation of Akt decreased significantly in Axn group. However, this effect was reversed by berberine in a concentration-dependent manner. Compared with Con group, the activation of HNF-1α/PDX-1 signaling pathway was inhibited in Axn group but recovered by berberine administration. The abilities of releasing insulin under normal or high-glucose stimulation were impaired in Axn group but recovered by berberine treatment in LBer group, MBer group and HBer group in a concentration-dependent manner.CONCLUSION: Berberine shows protective effects against alloxan-induced damage in beta cells by inhibiting apoptosis and recovering insulin secretion, thus attenuating the activation of PTEN/PI3K/Akt and HNF-1α/PDX-1 signaling pathways.

Berberine; β-cells; Apoptosis; Insulin

1000- 4718(2014)12- 2213- 06

2014- 07- 03

2014- 08- 03

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.017

△通訊作者 Tel： 0533-4252412; E-mail： axemaxme@sina.com