張應(yīng)花， 楊彩玲， 崔衛(wèi)剛， 王中平， 文小軍， 李瑞錫

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 衛(wèi)輝 453100；3復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，上海 200032； 4九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西 九江 332000)

舒林酸對丙戊酸孤獨癥動物模型大鼠氧化應(yīng)激變化的影響*

張應(yīng)花1△， 楊彩玲2， 崔衛(wèi)剛3, 1， 王中平3, 4， 文小軍1， 李瑞錫3

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 衛(wèi)輝 453100；3復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，上海 200032；4九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西 九江 332000)

目的： 探討舒林酸對孤獨癥發(fā)生過程中氧化應(yīng)激變化的影響。方法: 利用丙戊酸(VPA)孤獨癥動物模型，檢測經(jīng)典Wnt信號通路特異性抑制劑舒林酸處理后經(jīng)典Wnt信號通路及氧化應(yīng)激標(biāo)志物在孤獨癥模型大鼠前額葉皮質(zhì)及海馬腦區(qū)的表達變化。Western blotting法檢測糖原合成激酶3β(GSK-3β)、β-catenin和4-羥基壬烯醛(4-HNE)表達，半定量RT-PCR法檢測硫氧還蛋白(Trx)1和Trx2 mRNA表達。結(jié)果: 與對照組相比，在前額葉皮質(zhì)及海馬腦區(qū)VPA組GSK-3β蛋白表達減少，Trx1和Trx mRNA 表達減少，β-catenin與4-HNE的表達增加；而與VPA組相比，VPA與舒林酸同時處理組GSK-3β的表達顯著增加，β-catenin和4-HNE的表達顯著減少。結(jié)論: 舒林酸減少了孤獨癥發(fā)生過程中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，提示經(jīng)典Wnt信號通路上調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生，進而導(dǎo)致孤獨癥易感性增加。

孤獨癥； Wnt/β-catenin通路； 丙戊酸； 舒林酸； 氧化應(yīng)激

孤獨癥(autism)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。多數(shù)患兒有明顯的語言交流艱難、社會交往障礙和重復(fù)刻板行為三大核心表現(xiàn)，臨床上稱為“Kanner三聯(lián)征”。然而，目前孤獨癥的病因尚不清楚，對其發(fā)生、發(fā)展機制知之甚少。據(jù)報道，孤獨癥發(fā)生可能與 Wnt 信號通路傳導(dǎo)異常有關(guān)。敲除了該通路信號分子Dvl1 基因的小鼠表現(xiàn)出孤獨癥樣的社會行為異常，提示W(wǎng)nt信號通路可能與孤獨癥發(fā)病有關(guān)[1]。近年來，我們課題組檢測到孤獨癥模型大鼠存在 Wnt信號通路中關(guān)鍵信號蛋白表達異常[2-3]，同時采用表觀遺傳學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥大鼠動物模型腦內(nèi)存在去甲基化水平升高[2]，提示 Wnt信號通路機能亢進。Wnt信號通路下調(diào)可以導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[4]，而Wnt信號通路上調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[5]，進而可導(dǎo)致巨大腦和腦皮質(zhì)容量增加，這可能與孤獨癥腦早期的過度增生有關(guān)。以上這些資料表明孤獨癥發(fā)生與經(jīng)典Wnt信號通路傳導(dǎo)異常有關(guān)。

近年來研究顯示孤獨癥患者存在氧化穩(wěn)態(tài)的異常[6-7]。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，是導(dǎo)致孤獨癥患者腦區(qū)蒲肯野細(xì)胞缺失和存在其它神經(jīng)解剖學(xué)異常的一個重要因素[8]。Wnt 信號通路與氧化應(yīng)激是否存在關(guān)聯(lián)呢？Wnt 信號通路的一個分泌性抑制劑DKK1高表達可以減少類脂的聚集[9]，增加氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平[10]。乙醇可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致 Wnt 信號通路許多組成分子下調(diào)；但是與抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine， NAC) 共處理以后，乙醇的上述作用被減弱[11]。這就提示乙醇誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是通過下調(diào)Wnt信號通路發(fā)揮作用的。在孤獨癥發(fā)生過程中Wnt信號通路與氧化應(yīng)激的關(guān)系如何呢？丙戊酸(valproic acid，VPA)作為一種環(huán)境因素，導(dǎo)致子代孤獨癥的發(fā)生，這是否與調(diào)控個體發(fā)育的經(jīng)典Wnt信號通路傳導(dǎo)障礙，進而誘導(dǎo)氧化穩(wěn)態(tài)的異常從而導(dǎo)致孤獨癥的發(fā)生有關(guān)呢？因此，本研究旨在探索孤獨癥發(fā)生過程中經(jīng)典Wnt信號通路與氧化應(yīng)激的關(guān)系，揭示孤獨癥發(fā)生的可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和材料

健康成年 Wistar 雄性(300～350 g)及雌性(200～250 g)大鼠，購自中國科學(xué)院(上海)實驗動物部，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系專用動物房，給予充分的飼料和飲水。所有實驗動物喂養(yǎng)及實驗程序均嚴(yán)格遵照復(fù)旦大學(xué)實驗動物保護條款。

VPA和舒林酸(sulindac)購自Sigma；兔抗糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β， GSK-3β)抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗β-catenin抗體購于Santa Cruz；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于Jackson；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、蛋白酶抑制劑購于康成公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；2× PCR Mix購自Invitrogen。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 方法

2.1 孤獨癥大鼠模型建立及實驗分組 實驗前大鼠在周期性光照(7:00 AM～7:00 PM)、恒溫25 °C和恒濕55%條件下飼養(yǎng)1周，使之適應(yīng)環(huán)境。然后，按雌∶雄 2∶1 合籠過夜。第二天早晨，檢查到陰栓的雌鼠記為胚胎第1 天(embryoic day 1，E1)，然后受孕鼠分籠單獨飼養(yǎng)。將受孕母鼠隨機分成3組：模型組(VPA組)5只，在E12.5時給予母鼠腹腔注射600 mg/kg VPA；處理組(VPA+sulindac組)6只，在母鼠注射VPA后30 min給予5 mg/kg舒林酸；對照組(control組)4只，給予母鼠注射同等量的生理鹽水。各組母鼠產(chǎn)下的幼鼠，按照與母鼠對應(yīng)的分組各取8只。

2.2 孤獨癥模型動物生長發(fā)育和行為學(xué)檢測 參照 Schneider 等[12]所建立的方法并稍作改進，模型組和對照組幼鼠各6只進行生長發(fā)育與行為學(xué)檢測。觀察幼鼠出生后12、13、14、15和16 d的睜眼情況(0分：2只眼睛均未睜；1分：1只眼睛睜開；2分：2只眼睛都睜開)。出生后9、11、13和15 d的幼鼠進行游泳測驗，把幼鼠逐個單獨放于28 °C的恒溫槽中央，觀察5～10 s，根據(jù)動物耳朵與頭頂部處于水面的位置評分(0分：頭頂和鼻子都在水面以下；1分：鼻子在水面以下，頭頂在水面以上；2分：鼻子和頭頂在水面以上或者與水面平齊而雙耳在水面以下；3分：鼻子和頭頂?shù)奈恢门c2分標(biāo)準(zhǔn)相同，但水位線在耳朵中間；4分：鼻子和頭頂?shù)奈恢门c2分標(biāo)準(zhǔn)相同，要求水位線在耳朵以下)。

2.3 半定量RT-PCR檢測硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)1和Trx2 mRNA水平的表達 用Trizol提取大鼠前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex，PFC)及海馬(hippocampus，HC)腦組織總RNA。A260/A280比值在1.8～2.0之間。根據(jù)大鼠GenBank的基因序列使用Primer Design軟件進行引物設(shè)計。具體序列如下：Trx1的上游引物為5’-TTCTTTCATTCCCTCTGTG-3’，下游引物為5’-TCCGTAATAGTGGCTTCG-3’；Trx2的上游引物為5’-GGGCTTCCCTCACCTCTA-3’， 下游引物為5’-TGTTTGGCTACCATCTTCTC-3’；GAPDH的上游引物為5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’， 下游引物為5’-TGCTGACAATCTTGAGGGA-3’。RT-PCR按照說明書進行操作；反應(yīng)條件為：95 °C 5 min，然后95 °C 30 s，57 °C 30 s，72 °C 30 s,擴增30循環(huán)，最后72 °C 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在Runone DNA電泳系統(tǒng)中進行，用數(shù)字成像系統(tǒng)分析圖像，以目的基因灰度與內(nèi)參基因灰度比值代表目的基因的相對表達量。

2.4 Western blotting檢測GSK-3β、β-catenin和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)的表達 處理組、模型組和對照組冰上取全腦并分離出PFC及HC，用蛋白裂解液提取相應(yīng)組織總蛋白質(zhì)，用BCA法測定樣品的蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液后，100 °C加熱變性3 min。用12% 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)中分離蛋白，后轉(zhuǎn)移到膜上，5%牛血清白蛋白TBST搖床常溫封閉2 h。加I抗，4 °C搖床過夜；加II抗和GAPDH搖床常溫2 h，ECL發(fā)光顯色，然后將PVDF膜置于Bio-Rad的顯影機上，獲取反應(yīng)條帶的數(shù)字圖并將條帶進行灰度測定，以目的蛋白和內(nèi)參照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，分別對4-HNE及Trx1、Trx2 的mRNA在模型組和對照組中的相對表達定量值采用t檢驗，GSK-3β、β-catenin和4-HNE在處理組、模型組和對照組3組蛋白相對表達量比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孤獨癥模型動物生長發(fā)育及行為學(xué)檢測比較

睜眼情況評分顯示，睜眼時間有顯著差異(P<0.01)；其中模型組較對照組睜眼時間晚，模型組與對照組相比，在出生后 13 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義，出生后12、14、15 和16 d無顯著差異。游泳行為測試結(jié)果顯示，游泳評分有顯著差異(P<0.05)；其中模型組大鼠的游泳能力比對照組明顯低下，在出生后9和11 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);至出生后13 d，能力有所提高，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而發(fā)育到出生后15 d，游泳能力進一步提高,見表1。上述結(jié)果表明，以這些模型動物為實驗對象，做后續(xù)實驗是可靠的。

表1 孤獨癥模型睜眼和方位趨向感覺發(fā)育情況評估

PND:postnatal day.*P<0.05vscontrol.

2 孤獨癥大鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物4-HNE、Trx1和Trx2的表達變化

模型組PFC及HC組織的4-HNE蛋白表達高于對照組(P<0.05)；而模型組Trx1和Trx2 mRNA的表達低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1、2和表2。

Figure 1.The protein expression of 4-HNE in PFC and HC tissues of control and autism rats.

圖1 4-HNE在模型鼠與對照組大鼠PFC及HC腦區(qū)中的表達

Figure 2.The mRNA expression of Trx1 and Trx2 in PFC and HC tissues of control and autism rats.

圖2 Trx1及Trx2的mRNA在模型鼠與對照組大鼠PFC及HC腦區(qū)的表達

TableP<0.05vscontrol.

3 舒林酸處理后孤獨癥大鼠經(jīng)典Wnt信號通路的變化

Western blotting結(jié)果顯示，3組PFC及HC組織的GSK-3β蛋白表達有顯著差異，其中處理組高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，模型組GSK-3β蛋白的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3組PFC及HC組織的β-catenin蛋白表達有顯著差異，處理組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而模型組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3、表3。

Figure 3.The protein expression of GSK-3β and β-catenin in PFC and HC in the rats of 3 groups.

圖3 GSK-3β及β-catenin 蛋白在處理組、模型組與對照組大鼠PFC及HC腦區(qū)表達的變化

4 舒林酸處理后孤獨癥大鼠氧化應(yīng)激的變化

結(jié)果顯示，3組PFC及HC組織4-HNE的表達有顯著差異，其中處理組低于模型組，而4-HNE的表達模型組高于對照組(均P<0.05)，見圖4、表3。

Figure 4.The expression of 4-HNE in PFC and HC of the rats in 3 groups.

圖4 Sulindac處理后4-HNE在三組大鼠PFC及HC腦區(qū)中的表達

討 論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，舒林酸處理后經(jīng)典Wnt通路功能減弱，基于GSK-3β 表達增加，β-catenin表達減少。舒林酸下調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路活性同時，氧化應(yīng)激標(biāo)志物4-HNE表達減少。這些結(jié)果表明舒林酸減少孤獨癥發(fā)生過程中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，提示經(jīng)典Wnt信號通路上調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生，進而可能導(dǎo)致孤獨癥易感性增加。出生前或出生后環(huán)境因素，如VPA暴露可能會引起ROS產(chǎn)生[8]。ROS會干擾神經(jīng)發(fā)育進程，或者導(dǎo)致神經(jīng)中樞損傷，可能會導(dǎo)致行為學(xué)出現(xiàn)異常。這也暗示人體，特別是遺傳易感兒童發(fā)育關(guān)鍵時期環(huán)境毒物，如VPA暴露導(dǎo)致遺傳改變的可能機制就是氧化應(yīng)激的存在。本研究結(jié)果顯示，VPA孤獨癥模型動物的確存在氧化應(yīng)激，基于4-HNE產(chǎn)生增加及Trx1、Trx2 的mRNA表達減少。但是有報道指出VPA并不影響氧化DNA損傷標(biāo)志物8-OHdG、蛋白硝基化作用標(biāo)記物3-NT和4-HNE的表達[13]，這與本實驗結(jié)果并不一致。可能是由于使用的VPA濃度不同，或者與分布結(jié)構(gòu)對氧化應(yīng)激是否敏感有關(guān)。減少氧化應(yīng)激可能可以預(yù)防或至少減緩孤獨癥的發(fā)生。但是因為氧化應(yīng)激在許多病理情況下都存在，所以孤獨癥的發(fā)生可能是由于其它參與該病發(fā)生的因素，如經(jīng)典Wnt信號通路對氧化應(yīng)激作用所導(dǎo)致的。的確，本實驗結(jié)果顯示，舒林酸作為經(jīng)典Wnt信號通路的特異性抑制劑[14]，下調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路的同時，減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生，這可能與其具有減少細(xì)胞色素P450、具有抗氧化性質(zhì)有關(guān)[15]。

表3 GSK-3β、β-catenin和4-HNE蛋白在大鼠PFC及HC腦區(qū)的表達

TableP<0.05vscontrol；#P<0.05vsVPA.

綜上所述，經(jīng)典Wnt信號通路特異性抑制劑舒林酸能減少氧化應(yīng)激發(fā)生，這就提示經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生可能導(dǎo)致患孤獨癥易感性增加，同時也提示舒林酸的抗氧化性質(zhì)有可能對孤獨癥的產(chǎn)生有預(yù)防作用。鑒于動物模型的局限性，該結(jié)論擴展到孤獨癥患者需謹(jǐn)慎。而且對于神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病孤獨癥來說，探討不同年齡階段使用舒林酸對其氧化應(yīng)激的影響可能較一個橫斷面的研究更有意義，尤其利用孤獨癥模型動物在早期干預(yù)期進行相關(guān)研究，可能更有臨床意義。

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Effects of sulindac on oxidative stress in an autistic model induced by prenatal exposure to valproic acid

ZHANG Ying-hua1, YANG Cai-ling2, CUI Wei-gang3, 1, WANG Zhong-ping3, 4， WEN Xiao-jun1, LI Rui-xi3

(1DepartmentofHumanAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China;3DepartmentofAnatomy,HistologyandEmbryology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;4DepartmentofPhysio-logyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,JiujiangUniversity,Jiujiang332000,China.E-mail:zyhflo2013@163.com)

AIM: To investigate the effects of sulindac on oxidative stress in autism. METHODS: With an autistic model induced by prenatal exposure to valproic acid (VPA), we detected the expression of the signaling molecules of canonical Wnt pathway in the prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HC) of autistic rats treated with sulindac. The protein expression levels of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), β-catenin and 4-hydroxynonenal (4-HNE) were observed by Western blotting. The mRNA expression of thioredoxin(Trx)1 and Trx2 was assessed by semi-quantitative RT-PCR.RESULTS: The protein level of GSK-3β and mRNA levels of Trx1 and Trx2 were lower, whereas the protein expression levels of β-catenin and 4-HNE were higher in VPA group than those in control group. In contrast, the protein levels of GSK-3β were significantly higher in the animals treated with both VPA and sulindac than those in VPA group, while the levels of β-catenin and 4-HNE were decreased.CONCLUSION: Sulindac attenuates oxidative stress in the pathogenesis of autism, suggesting the up-regulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway disrupts oxidative homeostasis and further facilitates susceptibility to autism.

Autism; Wnt/β-catenin pathway; Valproic acid; Sulindac; Oxidative stress

1000- 4718(2014)12- 2161- 05

2014- 07- 04

2014- 09- 09

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81301174; No.81260211)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金資助項目(No.505003)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.008

△通訊作者 Tel： 0373-3029051； E-mail： zyhflo2013@163.com