李 薇， 曹 驥， 周玲麗， 羅 旺， 楊 春， 駱成飄， 李 瑗， 蘇建家

(廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

RNA干擾技術(shù)沉默CDC25a基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞HepG2增殖的影響*

李 薇， 曹 驥△， 周玲麗， 羅 旺， 楊 春， 駱成飄， 李 瑗， 蘇建家

(廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

目的： 研究細(xì)胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a，CDC25a)基因沉默后對于人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響。同時(shí)探討該影響發(fā)生的可能作用機(jī)制。方法: 使用RNA干擾技術(shù)沉默人肝癌HepG2細(xì)胞的CDC25a基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞中的CDC25a 及其作用基因cyclin E及CDK2的 mRNA表達(dá)水平，Western blotting檢測CDC25a的蛋白表達(dá)水平，并采用MTT法、Giemsa染色法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果: CDC25a 的mRNA及蛋白表達(dá)水平在RNA沉默組細(xì)胞中的表達(dá)低于陰性對照組及正常對照組細(xì)胞(P<0.05)。Cyclin E及CDK2 的mRNA表達(dá)水平在沉默組低于陰性對照及正常對照組(P<0.05)。MTT法、Giemsa染色法結(jié)果顯示沉默組細(xì)胞增殖能力低于陰性對照組及正常對照組細(xì)胞(P<0.05)，流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示沉默組細(xì)胞阻滯在G1期。 結(jié)論: LV-CDC25a-RNAi重組體感染HepG2細(xì)胞可以有效抑制CDC25a基因的表達(dá)，使人肝癌HepG2細(xì)胞增殖受到抑制，提示CDC25a基因可能是肝癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

基因，CDC25a； RNA干擾； 肝腫瘤

腫瘤發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多步驟累積的過程，最明顯區(qū)別于正常組織的是腫瘤細(xì)胞的生長具有自主性，即細(xì)胞增殖失控。有研究稱幾乎所有癌腫都表現(xiàn)出細(xì)胞周期紊亂或不規(guī)則，肝癌細(xì)胞作為消化系統(tǒng)常見腫瘤同樣也有如此表現(xiàn)。細(xì)胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a，CDC25a)屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其作用是活化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)/cyclin這個(gè)核心的復(fù)合體，因而該基因過度表達(dá)可使得細(xì)胞加速增殖，一旦平衡失調(diào)則會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。本課題組前期研究表明CDC25a蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)，并且肝癌患者分期、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)與該蛋白表達(dá)呈正相關(guān)[2]。為進(jìn)一步探討CDC25a基因在肝癌發(fā)生及發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建靶向CDC25a基因的siRNA慢病毒載體(LV-CDC25a-RNAi)并轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，將CDC25a基因沉默后觀察該基因?qū)τ诩?xì)胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、5種同時(shí)帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、CDC25a基因沉默重組慢病毒顆粒LV-CDC25a-RNAi(KD1、2、3、4、5)及對照慢病毒顆粒(LV-siRNA-NC)的包裝以及嘌呤霉素抗性篩選亦由上海吉凱基因技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)；DMEM、胎牛血清和PBS購自Gibco；細(xì)胞周期檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；噻唑藍(lán)(MTT)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司； Giemsa染液購自美國Chemicon；CDC25a單克隆抗體購自Abcam；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；近紅外染料標(biāo)記的Ⅱ抗購自LI-COR。 Odyssey紅外熒光成像儀為LI-COR產(chǎn)品；酶標(biāo)儀Elx800購自Biotek；流式細(xì)胞儀FACS Calibur為BD產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞株HepG2置于含10%胎牛血清、1%鹽酸左氧氟沙星的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞系HepG2接種于24孔板，每孔種細(xì)胞數(shù)為1.5×105個(gè)；12 h后細(xì)胞融合率達(dá)到20%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為20，實(shí)驗(yàn)組中分別加入LV-CDC25a-RNAi(KD1、2、3、4、5)， 陰性對照組加入LV-RNAi-NC， 空白對照組不做處理，常規(guī)培養(yǎng)。每隔24 h在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)陽性率。轉(zhuǎn)染后4～5 d可收獲細(xì)胞。

2.2 嘌呤霉素(puromycin)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 使用嘌呤霉素處理HepG2細(xì)胞，48 h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度，即為篩選濃度。實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后各孔加入含有4 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液， 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)有空白細(xì)胞加藥處理組進(jìn)行對照)， 轉(zhuǎn)染96 h后換液棄掉無嘌呤霉素抗性的細(xì)胞(非穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。

2.3 Western blotting檢測CDC25a蛋白表達(dá) 使用試劑盒提取7組細(xì)胞的總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度, 加入蛋白緩沖液，100 ℃變性5 min后放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?上樣50 μg, 經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白, 轉(zhuǎn)膜, 5%脫脂牛奶封閉2 h, 洗膜，加I抗(1∶100)，過夜孵育后洗膜，加II抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用Odyssey紅外熒光成像儀對PVDF膜進(jìn)行掃描。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CDC25a、cyclin E和CDK2的 mRNA表達(dá)水平 使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由TaKaRa(大連)合成，CDC25a 上游引物為5’-TTGGTGGATTTTGAAGGT-3’，下游引物為5’-AGTGAAGCCGTGATGGTA-3’，產(chǎn)物大小為233 bp；Cyclin E的上游引物為5’-GACCTAAAGGACTCCCACAACAAC -3’，下游引物為5’-AACGGAGCCCAGAACACCT -3’，產(chǎn)物大小為89 bp；CDK2的上游引物為 5’- ATCCGCCTGGACACTGAG -3’，下游引物為 5’-TCCGCTTGTTAGGGTCGT-3’，產(chǎn)物大小為165 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物為 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，產(chǎn)物大小121 bp。Trizol法分別提取實(shí)驗(yàn)組、陰性對照及空白對照組細(xì)胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃或60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每組細(xì)胞設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)擴(kuò)增目的及內(nèi)參照基因。采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算。

2.5 MTT法分析細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期3組細(xì)胞鋪板，每組5復(fù)孔，每孔100 μL(細(xì)胞數(shù)約為2 000每孔)。分別于種板后的24 h、48 h、72 h、96 h和120 h加入10 μL(5 g/L現(xiàn)配現(xiàn)用)的MTT，無需換液。4 h后加入100 μL DMSO終止反應(yīng)，振蕩器振蕩5～10 min，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度(A)值。

2.6 Giemsa染色檢測克隆形成 取對數(shù)生長期細(xì)胞以800個(gè)每孔將3組細(xì)胞接種于6孔板， 設(shè)每組3個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(保證濕度)中培養(yǎng)2周。Giemsa染色，在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

2.7 細(xì)胞周期檢測 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞按105每孔接種于6孔板中，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，每管取1×106個(gè)細(xì)胞；PBS洗細(xì)胞3次，離心去上清。70%乙醇固定細(xì)胞2 h。離心去固定液，PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次，每管加入 RNase 37 ℃水浴30 min后加入PI染液。室溫避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 判斷慢病毒的感染效率

轉(zhuǎn)染96 h后熒光最強(qiáng)，在含有不同干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞GFP熒光顯色均勻一致，表達(dá)強(qiáng)度無明顯差別，提示各組細(xì)胞的慢病毒感染效率無明顯差別，見圖1。

Figure 1.HepG2 cells were infected with the CDC25a-RNAi lentivirus for 96 h (×100).

圖1 CDC25a-RNAi慢病毒感染HepG2細(xì)胞

2 CDC25a 的mRNA表達(dá)和有效靶點(diǎn)的篩選

Real-time PCR結(jié)果顯示，與陰性對照及空白對照組相比，5個(gè)靶點(diǎn)中目的mRNA的表達(dá)水平均下調(diào)約80%左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以1號靶點(diǎn)敲減效率最高，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表1。

Figure 2.The mRNA expression of CDC25a in control group, NC group and experimental groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol and NC group.

圖2 CDC25a mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)

表1 靶點(diǎn)序列

3 CDC25a蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

以GAPDH作為內(nèi)參照，5組慢病毒感染組蛋白相對表達(dá)量相比陰性對照組相對表達(dá)量分別減少了82.61%±0.24%、77.54%±0.81%、78.26%±0.63%、76.09%±0.79%、76.09%±0.68%， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，綜合real-time PCR結(jié)果可認(rèn)定LV-CDC25a-RNA(KD1)作為最優(yōu)靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)CDC25a蛋白相對表達(dá)量為0.24±0.01，與陰性對照及空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

4 Cyclin E及CDK2的 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示cyclin E的mRNA表達(dá)量LV-CDC25a-RNAi組為0.493±0.160，陰性對照組為1.093±0.250，空白對照組為1.030±0.210；CDK2的mRNA表達(dá)量LV-CDC25a-RNAi組為0.654±0.120，陰性對照組為1.030±0.210，空白對照組為0.981±0.140。LV-CDC25a-RNAi組cyclin E及CDK2 的mRNA表達(dá)水平均低于陰性對照及空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Figure 3.Western blotting analysis of CDC25a proteins level in control group, NC group and experimental groups. Mean±SD.n= 12.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖3 CDC25a蛋白在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)量

Figure 4.The mRNA expression of cyclin E (A) and CDK2 (B) in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4 Cyclin E和CDK2 mRNA的表達(dá)量

5 細(xì)胞增殖活性結(jié)果

與陰性對照及空白對照組相比，轉(zhuǎn)染后各時(shí)段LV-CDC25a-RNAi組細(xì)胞490 nm處的A值均下降，但24 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其它4個(gè)時(shí)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

Figure 5.MTT analysis of the cell proliferation in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖5 MTT法檢測3組細(xì)胞的活力

6 各組細(xì)胞克隆數(shù)比較

Giemsa染色法檢測結(jié)果為LV-CDC25a-RNAi組低于陰性對照組及空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

Figure 6.Giemsa staining shows the clones in each groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖6 吉姆薩染色法顯示3組細(xì)胞的克隆數(shù)

7 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測結(jié)果(流式細(xì)胞術(shù))

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LV-CDC25a-RNAi組的G1期比例比陰性對照及空白對照組G1期比例升高(P<0.05)；LV-CDC25a-RNAi組G2期比例比陰性對照及空白對照組G2期比例降低(P<0.05)；LV-CDC25a-RNAi組S期比例比陰性對照及空白對照組S期比例降低(P<0.05)，3個(gè)時(shí)期各組細(xì)胞間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對照組和空白對照組對比兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

Figure 7.Flow cytometry analysis of the cell cycle in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比例

討 論

CDC25基因所表達(dá)的蛋白CDC25磷酸酶，屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，主要分為CDC25a、CDC25b、CDC25c 3種。CDC25a作用于cyclin A/CDK2和cyclin E/CDK2，促進(jìn)細(xì)胞從G1進(jìn)入S期[3]。有實(shí)驗(yàn)顯示，將CDC25a抗體顯微注射到增殖細(xì)胞中，可將增殖細(xì)胞阻滯在G1期[4]，提示CDC25a在G1/S期細(xì)胞周期進(jìn)程中有顯著作用。另有研究認(rèn)為，CDC25a在細(xì)胞凋亡中的作用存在差異，在胞質(zhì)中主要起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，而在胞核中則起到促進(jìn)凋亡的作用，總的來說，其作用主要以抑制凋亡為主[5]。CDC25a在許多類型的癌癥中過度表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及非霍奇金性淋巴瘤等[5-9]。Demidova等[10]發(fā)現(xiàn)CDC25a的過度表達(dá)可能是p53基因突變的結(jié)果。

Xu等[11]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中CDC25a基因同樣為過度表達(dá)狀態(tài)；郭艷等[12]研究發(fā)現(xiàn)CDC25a基因可能在肝癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，肝癌組織中CDC25a基因的表達(dá)與超聲影像相結(jié)合可為肝癌臨床治療及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CDC25a不僅在人肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在大鼠及樹鼩肝癌模型中同樣為高表達(dá)狀態(tài)，提示CDC25a表達(dá)水平的改變在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)中我們設(shè)計(jì)合成了CDC25a小分子干擾RNA，利用慢病毒作為載體，將含有CDC25a小分子干擾RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞中。通過real-time PCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)CDC25a基因被敲減的效果，并篩選出相對于陰性對照及空白對照組來說沉默效率最高的1號靶點(diǎn)。將1號靶點(diǎn)為最佳靶點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并大量培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組增殖活力明顯低于陰性對照及空白對照組，表明CDC25a沉默后的細(xì)胞增殖能力下降；Giemsa染色法檢測提示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞克隆能力比陰性對照及空白對照組的細(xì)胞弱；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果則顯示細(xì)胞被滯留于G1期，提示細(xì)胞增殖受到抑制。

上述細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNA干擾CDC25a基因后肝癌細(xì)胞的周期受到阻滯，細(xì)胞停留在G1期無法進(jìn)入S期進(jìn)行增殖，其增殖功能受到明顯抑制。有學(xué)者[15]提出CDC25a可作為癌癥藥物的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[13-14]，2008年有學(xué)者提出可以將CDC25a作為肝癌藥物治療的靶點(diǎn)。肝癌作為常見的消化系統(tǒng)腫瘤，具有發(fā)現(xiàn)晚，死亡率高的特點(diǎn)，治療手段主要以早期手術(shù)治療為主。目前國內(nèi)尚無沉默肝癌細(xì)胞中的CDC25a基因并觀察沉默細(xì)胞增殖能力變化這方面的研究，本實(shí)驗(yàn)從內(nèi)源性將肝癌細(xì)胞中的CDC25a基因沉默并后續(xù)進(jìn)行沉默細(xì)胞的增殖能力檢測，其結(jié)果為CDC25a基因成為肝癌藥物治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)提供更加有利的依據(jù)。

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Effects of RNA interference targetingCDC25agene on proliferation of human liver cancer HepG2 cells

LI Wei, CAO Ji, ZHOU Ling-li, LUO Wang, YANG Chun, LUO Cheng-piao, LI Yuan, SU Jian-jia

(InstituteforTreatmentandPreventionofTumor,GuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China.E-mail:caojicn@163.com)

AIM: To investigate the effect of silencing cell division cycle 25a (CDC25a) gene on the proliferation of human hepatoma HepG2 cells. METHODS:CDC25agene in human hepatoma HepG2 cells was silenced by RNA interference. Real-time PCR was applied to detect the expression of CDC25a, cyclin E and CDK2 at mRNA levels in the HepG2 cells. Western blotting was applied to detect the expression of CDC25a at protein level. In addition, MTT assay, Giemsa staining and flow cytometry were used to measure the proliferation of human hepatoma HepG2 cells. RESULTS: The expression of CDC25a at mRNA and protein levels in RNA silence group was lower than those in negative control group and normal control group (P<0.05). The mRNA expression of cyclin E and CDK2 in silence group was lower than that in negative control group and normal control group (P<0.05). The cell proliferation in silence group was lower than that in negative control group and normal control group (P<0.05). The results of flow cytometry revealed that the cells in silence group were blocked in G1phase. CONCLUSION: Infection of LV-CDC25a-RNAi recombinant to the HepG2 cells effectively inhibits theCDC25agene expression and the proliferation of human hepatoma cells, and arrests the cells in G1phase, suggesting thatCDC25agene may be a key target for the treatment of liver cancer.

Genes,CDC25a; RNA interference; Liver neoplasms

1000- 4718(2014)12- 2142- 06

2014- 07- 24

2014- 10- 31

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30960428)； 廣西科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項(xiàng)目(No. 10-108-25)； 廣西科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013GXNSFAA019210)

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.005

△通訊作者 Tel: 0771-5310593； E-mail: caojicn@163.com