李萬林，鐘姣姣，劉軍海

（陜西理工學院化學與環(huán)境科學學院，陜西 漢中 723001）

綠原酸又名咖啡酸，在植物界分布廣泛，是植物在有氧呼吸階段中產(chǎn)生的一種苯丙素類物質。其化學名為3-O-咖啡?？崴?，分子式為C16H18O9，分子量為 345.30［1］。綠原酸是一種具有廣泛生理活性和藥理活性的物質，具有清除自由基、止血、提高白血球數(shù)量、抗菌消炎、保肝利膽和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種功效［2］。它是一種高效新型的酚型天然抗氧化劑，強抗氧化性使得它具有增香和護色作用，可用于食品和果品保鮮［3］。它也可用于防止飲料和食品的腐敗變質。不僅如此，Wislka等人研究還發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以提高草莓等果汁的穩(wěn)定性。

葵花殼中綠原酸的提取對生產(chǎn)、生活都有相當重要的意義，筆者將微波協(xié)助萃取技術應用于葵花殼中綠原酸的提取，并對提取物進行抗氧化性清除羥基自由基的研究，可以為充分利用葵花殼提供理論依據(jù)，從而增加廢棄物的利用價值。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

葵花籽：漢中某大型農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)超市。

1.1.2 試劑材料

綠原酸標準品、無水乙醇、質量分數(shù)為30%的 H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵、Vc（抗壞血酸）、稀鹽酸、氫氧化鈉等，均為市售AR試劑。

1.1.3 實驗主要儀器

UWave-1000微波反應儀；UV-6300PC紫外可見分光光度計；DGG-9140B型鼓風干燥箱；KDF多功能食品粉碎機；標準檢驗篩：浙江上虞市道墟張興紗篩廠；JY3002電子天平；HH-系列電熱恒溫水浴鍋；旋片式真空泵。

1.2 實驗方法

1.2.1 繪制綠原酸標準曲線

參照參考文獻［4］的做法，按分光光度，測定出其吸光度，繪制綠原酸標準曲線方程，得到吸光度（y）與綠原酸濃度（x）之間滿足 y=0.0395x+0.1124（R2=0.9994），該式說明在測定范圍內線性關系良好。

1.2.2 原料預處理

為了去殼的便利，首先將葵花籽在較低的溫度下（30℃ ）加熱處理一段時間，待目測葵花殼差不多干燥時，取出，待溫度降到室溫。然后進行人工去殼，將所得的葵花殼放入鋪展開的報紙上，置于60℃電熱恒溫鼓風干燥箱中進行烘干，接著用多功能食品粉碎機粉碎，過篩取直徑小于0.05 mm的顆粒置于小燒杯中備用。

1.2.3 葵花殼中綠原酸的提取

準確稱取1.2.2中小燒杯中葵花殼粉末2 g置于錐形瓶中，加入一定量的一定濃度的乙醇溶液作為萃取劑，然后利用微波協(xié)助萃取技術處理，將處理后的錐形瓶置于水浴鍋中，趁熱過濾兩次，合并濾液。接著，將合并后的濾液迅速抽濾，將所得的濾液置于錐形瓶中備用。

1.2.4 葵花殼中綠原酸提取率計算公式

取1.2.3中錐形瓶中所得的濾液若干，在紫外可見分光光度計下進行分析，按下式計算綠原酸的提取率。

式中各符號表示如下：

w——葵花殼中綠原酸的提取率/mg/g

y——綠原酸濾液的吸光度

v——綠原酸濾液的體積/mL

n——濾液的稀釋倍數(shù)

m——葵花殼粉末的質量/g

1.2.5 葵花殼中綠原酸對羥基自由基的清除實驗

自由基被認為是人體衰老和某些慢性病發(fā)生的原因之一，當人體內的自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，它就會攻擊各種生物大分子，使正常的細胞和組織受損，加速其衰老并誘發(fā)多種疾病。在生物體內，需氧代謝的氧化還原反應所產(chǎn)生的羥基自由基，可以引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，損傷膜結構及功能并引起各類疾病，因此對羥基自由基的清除實驗具有重大的現(xiàn)實意義和醫(yī)學意義。

分別在編號為 1、2、3、4、5 的試管中依次加入4 mL不同濃度的樣品溶液、3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、3 mL 8 mmol/L H2O2溶液，搖勻，靜置 20 min，再加入3 mL 8 mmol/L水楊酸，搖勻，靜置60 min后，在510 nm處測得不同濃度下的吸光度A1，用水代替水楊酸測得某樣品濃度下的吸光度A2，用水代替樣品溶液測得空白對照吸光度A0［5-6］。

按照不同編號記錄上述相關數(shù)據(jù)，然后以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照品，按照下式計算清除率。

2 葵花殼中綠原酸提取工藝優(yōu)化

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度的影響

控制料液比（原料質量與萃取劑體積之比，下同）1：15，設置微波溫度50℃ 、微波功率200 W、微波時間2 min，用稀鹽酸或者稀氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為7，分別研究在乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%時對葵花殼中綠原酸提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知：隨著乙醇濃度的升高，葵花殼中綠原酸的提取率有一個先上升后下降的過程，在乙醇濃度為40%～60%之間，葵花殼中綠原酸的提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，在乙醇濃度為60%時綠原酸的提取率最高，故乙醇濃度選取60%為宜。

2.1.2 料液比的影響

取乙醇濃度為60%，在微波溫度50℃、微波功率200 W 、微波時間2 min的條件下，將溶液 pH 值調節(jié)為 7，研究料液比為 1：10、1：15、1：20、1：25、1：30時，對葵花殼中綠原酸提取率有何影響，結果見圖2。

由圖2可知：隨著料液比的增大，葵花殼中綠原酸提取率不斷增大，因為此時單位質量葵花殼周圍的乙醇含量增大，傳質推動力增大，提取率變大；但當料液比大于1：20后，綠原酸的提取率趨緩，這是由于葵花殼中綠原酸已達溶解平衡，此時再增大料液比不但令生產(chǎn)成本增高而且會使后續(xù)的純化過程復雜化，故料液比控制在1：20較合適。

2.1.3 微波溫度的影響

取乙醇濃度為60%，在微波溫度50℃、微波功率200 W、微波時間2 min的條件下，將溶液pH值調節(jié)為7，分別研究在微波溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃時對葵花殼中綠原酸提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知：在40℃ ～60℃之間，葵花殼中綠原酸提取率隨著微波溫度的升高而增大，在微波溫度為60℃時，葵花殼中綠原酸提取率最高。在60℃～80℃ 之間，隨著溫度的升高綠原酸提取率反而下降，這可能是因為綠原酸隨著溫度的升高一部分已被分解，所以60℃為較佳微波溫度。

2.1.4 微波功率的影響

取乙醇濃度為60% ，在料液比1：20、微波溫度60℃ 、微波時間2 min的條件下，將溶液pH值調節(jié)為7，分別研究在微波功率為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W時對葵花殼中綠原酸提取率的影響，結果見圖4。

由圖4可知：在微波功率100～300W之間，葵花殼中綠原酸提取率隨微波功率的增大而增大，300W之后綠原酸提取率反而降低，功率過大產(chǎn)生的局部過熱現(xiàn)象使綠原酸變性，提取率下降。因此，選擇300W為最佳微波功率。

2.1.5 pH值的影響

取乙醇濃度為60%，在料液比1：20、微波功率300 W、微波時間2 min、微波溫度60℃ 的條件下， 分別研究 pH 值為 4、5、6、7、8時對葵花殼中綠原酸提取率的影響，結果見圖5。

由圖5可知：當pH值為6時，葵花殼中綠原酸的提取效果最佳，而當提取環(huán)境處于過酸或堿條件下時，綠原酸的提取率反而都有所下降，這是由于在過酸或堿條件下，綠原酸可能會處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，從而導致提取率的降低，故適宜的pH值為6。

2.2 正交試驗優(yōu)化方法設計

2.2.1 正交試驗

在單因素實驗基礎上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、微波溫度（C）、微波功率（D）、pH（E）五個因素，設計5因素4水平的L16（45）正交試驗，以進一步優(yōu)化實驗條件。正交試驗的因素水平設計、實驗結果及極差分析見表1、表2。

表1 正交因素水平設計表

參照上述表1安排，進行正交試驗，正交試驗的結果及極差分析見表2所示。

表2 正交試驗結果及極差分析

由表2數(shù)據(jù)分析可知：微波協(xié)助萃取葵花殼中綠原酸的最佳工藝條件為：A2B2C2D2E2，即乙醇濃度60% 、料液比1：20、微波溫度60℃、微波功率300 W、pH值6。極差分析可得：影響葵花殼中綠原酸提取率的因素順序是C＞B＞A＞D＞E，即微波溫度 ＞料液比＞乙醇濃度 ＞微波功率＞pH。

2.2.2 正交試驗的方差分析

對表2實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果如表3所示。

表3 正交試驗結果的方差分析

由表3方差分析可知：微波溫度對微波協(xié)助萃取綠原酸的提取率影響顯著，其他因素都不顯著，因此，在實驗提取過程中應該控制微波溫度在合理的范圍內，防止對綠原酸的提取產(chǎn)生較大的影響。同時出于節(jié)約能源方面考慮，可減少微波時間、料液比的投入量。

2.2.3 正交試驗的結果

在最佳實驗工藝提取條件下，安排驗證性實驗，即在乙醇濃度60%、料液比1：20、微波溫度60℃ 、微波功率300 W 、pH值6的條件下，作平行實驗3次，取其平均值，得葵花殼中綠原酸最終提取率為 5.862 mg/g。

2.3 羥基自由基清除實驗結果及討論

實驗原理：fenton 反應［7］， 其實質是 H2O2在Fe2＋的催化作用下生成具有高反應活性的羥基自由基·OH，·OH可與大多數(shù)有機物作用使其降解［8］，若在體系內加入水楊酸，可與高反應活性的·OH反應生成有色物質，在510 nm處有最大吸收峰。若在體系內加入具有清除自由基作用的物質，它便會與水楊酸競爭，從而使有色物質的量減少。

按照 1.2.5中實驗步驟進行相關操作，計算羥基自由基清除率，繪制雙折現(xiàn)曲線如下圖所示：

（圖中“■”代表綠原酸粗提取物、“▲”代表對照品Vc）

由上雙線坐標圖上可以看出，在選定的濃度范圍內（即 100 μg/mL ～ 500 μg/mL），葵花殼中綠原酸粗提取物開始就顯示出較強的清除羥基自由基作用，且比陽性對照品抗壞血酸高，而且隨著質量濃度的進一步增大，這種清除能力更強，清除效果更好，最大清除率可達60.42%。然而在同樣濃度下，抗壞血酸的最大清除率為52.42%，二者相差8%，說明葵花殼中綠原酸粗提取物對·OH具有較強的的清除能力，可為開發(fā)清除自由基藥物提供一定的實驗依據(jù)?；蛟S，在不久的將來，綠原酸可作為強清除自由基藥物制劑投入生產(chǎn)。

3 實驗結論

（1）通過微波法協(xié)助萃取葵花殼中綠原酸提取工藝條件的研究，可知：各因素對葵花殼中綠原酸提取率的影響次序為：微波溫度 ＞料液比 ＞乙醇濃度＞微波功率＞pH。

（2）在乙醇濃度 60% 、料液比 1：20（g/mL）、微波溫度60℃ 、微波功率300 W、pH值6、提取1次的最佳工藝條件下，葵花殼中綠原酸提取率為5.862 mg/g?？ぶ械木G原酸粗提取物對·OH具有較強的清除能力，且其清除效果與Vc相比要更好。

［1］王輝，田呈瑞，馬守磊，等.綠原酸的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2009， （5）： 341-345.

［2］李萬林.金銀花中微波輔助提取綠原酸工藝條件研究［J］.江西飼料，2013， （3）：3-6.

［3］戴自英.臨床抗菌藥物學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：219-223.

［4］李萬林.向日葵花盤中綠原酸的微波輔助提取工藝條件研究［J］.皮革與化工，2013，30（3）：14-18.

［5］Smirone N，Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes ［J］.Phytochemistry，Polysaccharides to Hydroxyl Radieals，1989，28：1057-1060.

［6］李旭，劉婷.杜仲葉總黃酮微波輔助提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究 ［J］. 食品工業(yè)科技，2013， （3）：243-248.

［7］Chamarro E， Marcoa， Esplugass.Use of Fention reagent toimprove organic chemical biodegradability ［J］.Water Research，2001，35（4）：1 047-1 051.

［8］Li CW，Chen YM，Chiou YC， et al.Dye waste water treated by Fenton process with ferrous ions electrolytically generated from iron-containing sluge［J］.Journal of Hazardous Materials，2007，144（2）：95-108.