金超，程妍，符華林*，蔣公建，舒剛，劉夢嬌，周建瑜，戴玉嬌

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系，四川 雅安 625014；2.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；3.重慶先鋒動物藥業(yè)有限公司，重慶 萬州 404100；4.重慶市潼南縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶 潼南 402660)

對乙酰氨基酚(paracetamol，acetaminophen，apamid，APAP)又名撲熱息痛，為乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥。美國、英國、日本等國的《藥典》和《中國藥典》均已收載此藥，是全世界應用最廣泛的藥物之一[1]。該藥現(xiàn)在主要應用的劑型是片劑和膠囊劑，獸醫(yī)臨床多用注射劑。APAP 易溶于有機溶劑、微溶于水，其注射劑常用聚乙二醇400 和乙醇等有機溶劑做溶媒，但有機溶劑刺激性大且不利于吸收，導致藥物不能很好的發(fā)揮療效。

前體藥物(pro–drug)是指經(jīng)過生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化后才具有藥理作用的化合物，其本身沒有生物活性或活性很低，經(jīng)過體內(nèi)代謝后變?yōu)橛谢钚缘奈镔|(zhì)。最常見的有載體前藥，其在體內(nèi)經(jīng)酶促或非酶化學反應，轉(zhuǎn)變成原藥而發(fā)揮作用[2–5]。將藥物制成前藥可以改善藥物的溶解性、減少藥物不良反應、提高藥物靶向性[6]。APAP 較差的水溶性常常限制其制劑加工和臨床應用，但其結(jié)構(gòu)中含有活性基團，為此筆者根據(jù)前藥設計思路，將APAP 的4 位酚羥基與琥珀酸酐酰化，制成對乙酰氨基酚的琥珀酸酯(AP–S)[7]。新合成的AP–S 水溶性良好，有利于其水溶性制劑研發(fā)，并且能夠有效解決有機溶劑的刺激性等難題，以達到增加藥物在動物機體內(nèi)的吸收、提高生物利用度和藥效的目的[5]。

本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，AP–S 進入動物機體后很快分解成APAP，藥物在體內(nèi)以APAP 的形式存在而發(fā)揮其療效，因此，在研究AP–S 家兔肌肉注射藥代動力學時，可以APAP 血藥濃度的變化來反映AP–S 的體內(nèi)藥代動力學特征。本研究先建立測定血液中APAP 的濃度的HPLC 法，并用此方法測定家兔單劑量肌肉注射AP–S 后的APAP 的血藥濃度，旨在探明AP–S 在家兔體內(nèi)的藥化動力學特征，為AP–S 的臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試兔

6 只健康日本大耳家兔，體重(2 .0±0.2) kg，購自四川農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心。

1.1.2 主要藥品與試劑

對乙酰氨基酚琥珀酸酯為實驗室自制；對乙酰氨基酚購自四川成都科龍化工試劑廠，生產(chǎn)批號20100421；琥珀酸酐購自天津瑞金特化學品有限公司；4–二甲氨基吡啶購自成都科龍化工試劑廠；色譜甲醇購自天津科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.1.3 主要試驗儀器

85–2 型恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；RE–2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；TB–Z 真空恒溫干燥箱(天津藥典標準儀器廠)；島津LC–2010CHT 高效液相色譜系統(tǒng)(島津國際貿(mào)易上海有限公司)；LG16–3 高速冷凍離心機(美國科峻儀器公司)。

1.2 方 法

1.2.1 血漿中對乙酰氨基酚含量的測定

1) 測試條件。色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫為20 ℃；流動相為甲醇∶1%冰醋酸=12∶88(v/v)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長為244 nm；進樣體積為20 μL。

2) 血漿處理及HPLC 分析。從耳緣靜脈采集未經(jīng)處理的家兔血液1 mL，置于肝素化離心管中，5 000 r/min 離心10 min，吸取待測上清0.5 mL(空白血漿)，加入甲醇1 mL，渦旋混合1 min 后10 000 r/min 離心5 min，取上清1 mL，真空干燥，干燥物用0.5 mL 甲醇復溶，渦旋混合，10 000 r/min 離心10 min，上清液用一次性0.45 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜過濾，取20 μL 進行HPLC 分析[8]。

3) 血漿標準曲線的制備。精密稱取0.1 g 干燥的對乙酰氨基酚，用注射用水溶解，配置成1 000 μg/mL 的母液。將母液配制為1.5、3.0、6.0、15、30、60、150、300、450 μg/mL 的對乙酰氨基酚標準藥液，分別取0.5 mL 家兔空白血漿與0.5 mL 藥液混合配成對乙酰氨基酚血漿樣品后按上述的方法進行HPLC 分析，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標繪制標準曲線，經(jīng)最小二乘法將峰面積對藥物濃度進行回歸分析，得對乙酰氨基酚血漿標準曲線方程[9–10]。

4) 檢測限與定量限的確定。按上述方法獲得空白血漿，制成低濃度的乙酰氨基酚血漿樣品，處理后進行HPLC 測定。將引起3 倍基線噪音的藥物質(zhì)量濃度定義為檢測限；將引起10 倍基線噪音的藥物質(zhì)量濃度定義為定量限[10]。

5) 精密度試驗。按上述方法配制低、中、高(分別為0.5、10、150 μg/mL )3 種濃度的對乙酰氨基酚血漿樣品各3 份，24 h 內(nèi)按血漿處理與色譜分析方法平行測定5 次，計算日內(nèi)精密度。連續(xù)測定5 d，每天1 次，計算日間精密度。

6) 回收率試驗。絕對回收率按血漿標準曲線的制備中的方法配制低、中、高(0.5、10、150 μg/mL )3種濃度的對乙酰氨基酚血漿樣品各3 份，另用甲醇做溶劑配制相同濃度的對乙酰氨基酚樣品各3 份，按血漿處理的步驟操作并進行色譜分析，得低、中、高3 種濃度的血漿樣品的絕對回收率。

相對回收率按血漿標準曲線的制備中的方法配制低、中、高(0.5、10、150 μg/mL) 3 種濃度的對乙酰氨基酚血漿樣品各3 份，按血漿處理的步驟操作并進行色譜分析，記錄峰面積并代入標準曲線，計算所得濃度與真實血樣濃度比較，得到低、中、高3 種濃度的標準血漿樣品的相對回收率。

藥物穩(wěn)定性考察。按血漿標準曲線的制備中的方法配制低、中、高(0.5、10、150 μg/mL) 3 種濃度的對乙酰氨基酚血漿樣品，在–20 ℃下將各樣品放置0、24、48 和72 h 后，按照上述測試的條件進行HPLC 測定。

1.2.2 AP–S 的藥代動力學分析

1) 藥液的配制。精密稱取定量的對乙酰氨基酚琥珀酸酯，溶解在5%的碳酸氫鈉溶液中，配制成50 mg/mL 的藥液，備用。

2) 給藥與血樣采集。供試兔在試驗動物房中飼喂1 周后，禁食12 h。按照50 mg/kg 給供試家兔肌肉注射對乙酰氨基酚琥珀酸酯前藥溶液。給藥前每只兔取血液各1 mL，分別置于肝素化試管中，給藥0.083、0.25、0.50、0.75、1、1.5、2、4、6、8 h 后，分別從耳緣靜脈取血1 mL，注入肝素化試管，5 000 r/min 離心10 min，準確吸取上層血漿，存 –20 ℃冰箱，備用[11]。按照上述測試條件對血漿樣品進行HPLC 分析，根據(jù)標準曲線計算對乙酰氨基酚的血藥濃度。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.0 藥代動力學軟件進行各種藥代動力學模型擬合，計算各組數(shù)據(jù)的藥代動力學參數(shù)及其標準偏差；血藥濃度和相關的藥代動力學參數(shù)用 SPSS17.0 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學評價

2.1.1 方法專屬性分析結(jié)果

圖1 家兔空白血漿的HPLC 分析結(jié)果Fig.1 HPLC of the blank plasma of rabbit

由圖1、圖2 可知，在本試驗色譜條件下，血漿峰與藥物分離完全，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對測定結(jié)果 無干擾，血漿中對乙酰氨基酚峰形良好，分離完全，蛋白峰干擾極小，對乙酰氨基酚的保留時間約為7.8 min，表明本對乙酰氨基酚色譜檢測方法有較高的專屬性。

圖2 家兔空白血漿中加入APAP 的色譜分析結(jié)果Fig.2 HPLC of the blank plasma of rabbit with APAP

2.1.2 標準曲線、檢測限和定量限

對乙酰氨基酚的血漿標準曲線見圖3。曲線方程為A=40 471C－2 278.8，R2= 0.999，其中，A 為峰面積，C 為藥物濃度，R 為相關系數(shù)。從圖3 可知，在0.75～150 μg/mL 范圍內(nèi)標準曲線線性關系良好，檢測限為0.1 μg/mL，定量限為0.4 μg/mL。

圖3 對乙酰氨基酚的血漿標準曲線Fig.3 Standard curve of paracetamol

2.1.3 精密度與回收率試驗結(jié)果

血漿中3 種不同濃度對乙酰氨基酚的檢測精密度和回收率見表1。不同濃度對乙酰氨基酚的絕對回收率均大于75%，藥物提取率均較高，說明血漿樣品處理方法能使對乙酰氨基酚很好的從血漿中分離；精密度和回收率的相對標準偏差(RSD)值均小于5%，符合生物供試品分析的要求，證明本試驗所采用的測定方法和血漿樣品處理方法可靠，可用于家兔血漿中對乙酰氨基酚的含量測定。

表1 對乙酰氨基酚血藥濃度的精密度和回收率Table 1 Precision and recovery test of paracetamol in rabbit plasma

2.1.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表2 可知，3 個濃度的乙酰氨基酚血漿樣品分別在7 ℃低溫處24、48、72 h 后，用HPLC 檢測到的濃度與初始濃度差異較小，說明不同濃度的對乙酰氨基酚在血漿中的穩(wěn)定性很好，表明冰凍放置血漿樣品較為穩(wěn)定。

表2 對乙酰氨基酚血漿樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Stability of paracetamol in rabbit plasma μg/mL

2.2 AP–S 在家兔體內(nèi)的藥代動力學特征

由圖4 可知，AP–S 進入家兔體內(nèi)后轉(zhuǎn)換成APAP，且血漿中APAP 峰形良好，分離完全，蛋白峰干擾極小，與空白血漿中添加APAP 的HPLC 分析結(jié)果一致，證明建立的本方法可用于AP–S 的藥代動力學分析。

圖4 注射AP–S 30 min 后血漿樣品HPLC 圖譜Fig.4 HPLC of AP–S at minute 30 post-injection

家兔肌肉注射AP–S 后，不同時間血藥濃度的藥時曲線見圖5。從圖5 可知，AP–S 在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)換成APAP，其達峰時間為0.25 h，證明APAP 制備成水溶性的AP–S 后，藥物吸收迅速，能夠更快的發(fā)揮APAP 的藥效。

圖5 AP–S的藥時曲線Fig.5 Concentration-time curve of AP–S

將給藥后不同時間收集的血液的血藥濃度經(jīng)DAS2.0 程序處理，用二室模型估算藥代動力學參數(shù)，得到AP–S 的藥化動力學參數(shù)見表3。家兔按50 mg/kg 肌肉注射AP–S 后，其主要藥化動力學參數(shù)Cmax為(95.44±1.42) mg/L，tmax為(0.25±0.006 6) h，AUC(0–∞)為(84.08±7.02) mg/L·h，這與關皎[12]等按100 mg/kg 肌肉注射后的tmax(1.08±0.20) h 相比，AP–S藥物達峰時間明顯提前，藥物發(fā)揮作用更加迅速。

表3 AP–S 藥代動力學參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of AP–S

3 討 論

蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation) 。常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有鹽析法與有機溶劑沉淀法，常用試劑分別為飽和硫酸銨與甲醇。由于硫酸銨為無機鹽，且其中常含有少量重金屬離子，在血漿處理后續(xù)過程中，加入的甲醇可能會導致殘留在溶液中的硫酸銨析出，從而堵塞色譜柱，而有機溶劑沉淀法的分辨能力比鹽析法更高，其中甲醇又有將藥物從血漿中萃取出來的功能，故本試驗選擇甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑。本試驗的結(jié)果表明，雖然甲醇會導致蛋白質(zhì)變性，但并不影響試驗結(jié)果。

由于APAP 微溶于水，其注射劑常用聚乙二醇400、丙二醇、乙醇等有機溶劑做溶媒。但人體和動物機體是一個水性環(huán)境，有機溶劑溶解藥物進入體內(nèi)后存在刺激性大和不利于吸收的缺點，所以藥物不能很好的發(fā)揮療效。關皎[12]等采用50% 丙二醇水溶液溶解APAP，研究其藥化動力學特征，其達峰時間是(1.08±0.20) h，明顯比本試驗AP–S 的達峰時間(0.25 h)長，證明有機溶劑能使藥物的吸收減慢，不利于藥效的發(fā)揮。

AP–S 是在APAP 的結(jié)構(gòu)上進行改造，添加了一個水性載體基團，添加的水性基團分子量較小，進入體內(nèi)后載體在酶等物質(zhì)的作用下很快與藥物分離。本試驗將AP–S 溶解在水性溶液中，肌肉注射進入動物機體內(nèi)后，AP–S 能夠很快被吸收進入血液中，隨著血液循環(huán)到達全身，發(fā)揮療效。

藥物動力學中隔室模型的劃分具有相對性，對于同一藥物，由于實驗條件或者數(shù)據(jù)處理能力存在差異，會造成同一機體內(nèi)試驗結(jié)果的不同[13]。關皎[12]等的研究表明，對乙酰氨基酚在家兔體內(nèi)的藥化動力學符合單室模型。本試驗結(jié)果表明二室模型能更好的描述AP–S在家兔體內(nèi)的藥化動力學特征。

王柳萍[15]等在對乙酰氨基酚藥化動力學研究進展中表明，采用HPLC–UV 法測定對乙酰氨基酚血藥濃度，方法簡單快捷，具有較高的專屬性。本試驗結(jié)果表明，HPLC 能準確測定血漿中對乙酰氨基酚的濃度，靈敏度高，精密度與重現(xiàn)性良好，與用紫外分光光度法相比[12]，本研究建立的乙酰氨基酚高效液相色譜法測定的血藥濃度的線性范圍更廣，檢測限更低，檢測的靈敏度更高。

[1]金慧萍，李中東，焦正．對乙酰氨基酚的不良反應與合理使用[J]．藥物不良反應雜志，2004，6(1)：27–31．

[2]Randolph R J，Vasilis A，Asma P，et al．Phytoestrogens as natural prodrugs in cancer prevention：Dietary flavonoids[J]．Phytochemistry Reviews，2009，8(2)：375–386．

[3]Thatcher N J，Edwards R J，Lemoine N R，et al．The potential of acetaminophen as a prodrug in gene-directed enzyme prodrug therapy[J]．Cancer Gene Therapy，2000，7(4)：521–525．

[4]操鋒，平其能，陳軍．口服前藥研究：機遇與挑戰(zhàn)[J]．藥學學報，2008，43(4)：343–349．

[5]Fadl T，Omar F．Paracetamol (acetaminophen) esters of some non-steroidal anti-inflammatory carboxylic acids as mutual prodrugs with improved therapeutic index[J]. Inflammopharmacology，1998，6(2)：143–157．

[6]王淑月，王洪亮．前藥原理與新藥設計[J]．河北工業(yè)科技，2003，20(1)：54–57．

[7]金超，靳曉優(yōu)，唐文，等．對乙酰氨基酚琥珀酸酯的合成及其表征分析[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(3)：220–223．

[8]高守紅，范國榮，吳志明，等．對乙酰氨基酚緩釋干混懸劑在家犬體內(nèi)的藥代動力學及相對生物利用度[J]．第二軍醫(yī)大學學報，2004，25(9)：1031–1032．

[9]鄒玉珠，符華林，張偉，等．甲氧芐啶羥丙基–β–環(huán)糊精包合物的制備及在家兔體內(nèi)的藥代動力學研究[J]．中國獸醫(yī)科學，2010，40(12)：1285–1290．

[10]符華林，張偉，陳靜，等．氟苯尼考琥珀酸鈉的制備及其在家兔體內(nèi)的藥代動力學特征[J]．中國獸醫(yī)科學，2011，41(6)：636–640．

[11]陳小軍，孫志良，崔建國，等．阿米卡星脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)的藥化動力學研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2005，31(1)：73–75．

[12]關皎，王丹，郝乘儀，等．對乙酰氨基酚家兔體內(nèi)藥化動力學研究[J]．吉林醫(yī)藥學院學報，2012，32(5)：276–278．

[13]梁文權．生物藥劑學與藥物動力學[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009．

[14]王玉，張喆，陳西敬，等．高效液相色譜法測定對乙酰氨基酚的血藥濃度及其生物利用度[J]．中國臨床藥學雜志，2002，11(2)：97–99．

[15]王柳萍，楊斌．對乙酰氨基酚藥化動力學研究進展[J]．時珍國醫(yī)國藥，2011，22(2)：469–470．