邱 琳 季一凡 朱成成 陳韻聰 何衛(wèi)江＊, 郭子建＊,

(1南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)

(2常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，常州 213164)

作為人體內(nèi)最重要的過(guò)渡金屬離子之一，鋅離子不僅參與了神經(jīng)信號(hào)傳遞、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等生理過(guò)程[1-2]而且還與許多疾病如老年癡呆癥、糖尿病、前列腺癌等的病理過(guò)程相關(guān)[3-5]。利用熒光探針檢測(cè)鋅離子在生命體系中的實(shí)時(shí)分布信息對(duì)理解這些相關(guān)過(guò)程具有重要的意義，因此發(fā)展鋅離子熒光探針是目前研究的熱點(diǎn)之一[6]。除了紫外激發(fā)的經(jīng)典探針TSQ系列外[7],目前報(bào)道較多的Zn2+探針主要有ZP系列[8]和ZnAF[9]系列，也是目前最為成功的鋅離子探針。這兩類(lèi)探針均基于熒光素而設(shè)計(jì)，一般激發(fā)在490 nm左右，發(fā)射在520 nm左右。顯然發(fā)展具有更長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的鋅離子熒光不僅有利于進(jìn)行各類(lèi)細(xì)胞共染造影，而且有利于降低自發(fā)熒光、光毒性及光漂白等短波長(zhǎng)造影中的不足。

用于探針設(shè)計(jì)的典型熒光團(tuán)有熒光素[9-11]、萘酰亞胺[12-14]、香豆素[15-16]、川菁[17-18]、羅丹明[19-21]以及氟硼吡咯[22-23](4-difluoro-4-borata-3a-azonia-4a-aza-s-indacene，BODIPY)等。其中BODIPY類(lèi)染料分子有較高的剛性和芳性，因此該類(lèi)染料具有良好的光穩(wěn)定性、較高的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。由于這類(lèi)分子還具有發(fā)光性能環(huán)境依賴性小、吸收及發(fā)射帶較窄等優(yōu)點(diǎn)，因而基于BODIPY的探針設(shè)計(jì)報(bào)道較多[24-25]，以BODIPY來(lái)構(gòu)筑鋅離子熒光探針有利于降低光漂白延長(zhǎng)造影時(shí)間，并為各類(lèi)共染造影和不同激發(fā)光源配置的造影設(shè)備提供更多的選擇。然而常見(jiàn) BODIPY探針 Stokes位移較小(＜20 nm)，易造成激發(fā)干擾。它們的激發(fā)波長(zhǎng)一般在500 nm左右，與熒光素類(lèi)探針的激發(fā)過(guò)于接近，共染時(shí)易發(fā)生相互影響。BODIPY通常發(fā)出綠色熒光，波長(zhǎng)在510 nm左右的，較易受到自發(fā)熒光干擾。根據(jù)Rurack等人的報(bào)道，BODIPY類(lèi)熒光團(tuán)α-位進(jìn)行推電子基取代苯乙烯修飾，不僅可明顯增強(qiáng)BODIPY分子內(nèi)存在的ICT效應(yīng)，而且能顯著提高BODIPY熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)、增加斯托克斯位移[26]。這些均有利于進(jìn)一步降低造影中的自發(fā)熒光干擾、光毒性和激發(fā)干擾。據(jù)此我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)新的基于BODIPY的Zn2+熒光探針 BDP-m-BPA(圖 1)。在探針?lè)肿又衜eso-位引入了將對(duì)位氨基修飾為Zn2+螯合團(tuán)bis(2-pyridylmethyl)amine(BPA)[27-28]的苯環(huán)。其中BPA基團(tuán)的氨基將對(duì)BODIPY熒光團(tuán)的熒光具有PET淬滅效應(yīng)[28]。BPA與Zn2+配位將導(dǎo)致PET效應(yīng)的阻斷并誘導(dǎo)探針?lè)肿拥臒晒庠鰪?qiáng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Zn2+的增強(qiáng)響應(yīng)。α-(4-羥基)苯乙烯的引入可擴(kuò)展分子的共軛體系并促進(jìn)ICT效應(yīng)以提高探針的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并增大Stokes位移。

圖1 探針BDP-m-BPA的合成路線Fig.1 Synthesis of sensor BDP-m-BPA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

合成中常用試劑和溶劑均為國(guó)內(nèi)商業(yè)試劑，其中二氯甲烷經(jīng)CaH2干燥后使用，甲苯經(jīng)鈉/二苯甲酮回流干躁后使用，其余試劑未做純化。三氟乙酸(TFA)和 2，4-二甲基吡咯購(gòu)自 Alfa公司。N，N，N′，N′-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)，Zn(NO3)2，三羥甲基氨基甲烷(Tris)和用于光譜及造影測(cè)試中的各類(lèi)無(wú)機(jī)鹽均為來(lái)自Aldrich和Alfa的分析純?cè)噭?。光譜測(cè)試中所用溶劑如乙醇等為Aldrich光譜純?cè)噭?，水為?jīng)MILIPORE處理的超純水。電噴霧質(zhì)譜用LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)測(cè)定，并用ISOPRO 3.0程序模擬其同位素分布模式。探針?lè)肿痈叻直尜|(zhì)譜用 Agilent 6540Q-TOF HPLC-MS測(cè)定。1H，13C NMR在Bruker DRX-500或Bruker DRX-600核磁儀上用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列測(cè)定 (298 K))。紫外光譜用PerkinElmer Lambda 35紫外可見(jiàn)光譜儀測(cè)定。熒光光譜在Horiba Scientifc Fluoromax-4發(fā)光光譜儀上測(cè)定。pH值用PHS3精密pH計(jì)記錄。

1.2 熒光配體BDP-m-BPA的合成

1.2.1 化合物 2 的合成

化合物1采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[29]。氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物 1(0.303 g，1 mmol) 和 2，4-二甲基吡咯(0.190 g，2 mmol)用 50 mL 無(wú)水二氯甲烷溶解，加入一滴TFA后室溫?cái)嚢鑋30]。TLC跟蹤至化合物1反應(yīng)完全。加入無(wú)水二氯甲烷溶解的DDQ(0.220 g，1 mmol)后繼續(xù)攪拌30 min。隨后加入2 mL無(wú)水三乙胺攪拌5 min，繼續(xù)加入2 mL BF3·Et2O攪拌1 h。將混合物用飽和食鹽水洗滌一次后以無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層，硅膠柱層析分離(200～300 目，VCH3OH∶VAcOEt=1∶10)得到橘色固體 102 mg，產(chǎn)率 20%。1H NMR(300 MHz，CDCl3) δ=1.47(s，6H)，2.56(s，6H)，4.91(s，4H)，5.97(s，2H)，6.82(d，J=8.5 Hz，2H)，7.02(d，J=8.5 Hz，2H)，7.23(m，J=12 Hz，2H)，7.27(d，J=8 Hz，2H)，7.67(t，J=15 Hz，2H)，8.63(d，J=4.5，2H)。

1.2.2 化合物 3 合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物 2(0.240 g，0.46 mmol)，對(duì)羥基苯甲醛(0.060 g，0.50 mmol)，0.10 mL 哌啶，少量4A分子篩，一起置于5 mL無(wú)水甲苯中混合加熱至110℃并維持24 h[30]。冷卻至室溫后蒸干溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離 (200～300 目，VAcOEt∶VMeOH=20∶1)得到深紫紅色固體60 mg,產(chǎn)率21%。1H NMR(500 MHz，CD3OD) δ=1.45(s，3H)，1.50(s，3 H)，2.50(s，3H)，4.95(s，4H)，6.02(s，1H)，6.69(s，1H)，6.83(d，J=10 Hz，2H)，6.87(d，J=10 Hz，2H)，7.03(d，J=8 Hz，2H)，7.31(m，J=35 Hz，3H)，7.37(d，J=8 Hz，2H)，7.44(m，J=25 Hz，3H)，7.79(t，J=15 Hz，2H)，8.55(d，J=5 Hz，2H)。

1.2.3 目標(biāo)化合物BDP-m-BPA的合成

60 mg化合物3加入2 mL醋酸酐加熱至50℃，維持8 h后結(jié)束反應(yīng)[31]。減壓蒸干溶劑，用二氯甲烷洗滌得到深藍(lán)色固體，產(chǎn)率90%。1H NMR(600 MHz，CDCl3) δ=1.37(s，3H)，1.41(s，3H)，2.58(s，3H)，3.99(s，3H)，4.90(s，4H)，5.99(s，1H)，6.59(s，1H)，6.73(d，J=12 Hz，2H)，7.20(m，J=42 Hz，3H)，7.26(d，J=12 Hz，2H)，7.46(m，J=42 Hz，5H)，7.67(t-d，J=24 Hz，6 Hz，2H)，8.19(d，J=12 Hz，2H)，8.67(d，J=6 Hz，2H)ppm。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ=14.44，14.64，14.80,29.71,55.37,56.49,112.87,115.59,117.87,120.99,121.90,126.46,128.76，129.38，130.26，130.71，130.90,132.49,136.99，138.73，140.18，141.17，142.40,148.11,148.36,154.45,154.20,157.40,166.53。HRMS(EI)(positive mode，m/z)：Calcd.668.300 3，F(xiàn)ound 668.301 5 for[M+H]+。

1.3 BDP-m-BPA的熒光、吸收光譜及其Zn2+滴定測(cè)試

取BDP-m-BPA的乙醇儲(chǔ)備液加入到100 mL的容量瓶中并用Tris-HCl緩沖溶液 (20 mmol·L-1，pH=7.20) 和乙醇定容，配成濃度為 10 μmol·L-1的(VC2H5OH∶Vwater=1∶1)溶液進(jìn)行吸收和熒光光譜測(cè)量。吸收光譜和熒光光譜滴定均通過(guò)向3 mL BDP-m-BPA溶液中分別加入等分體積的Zn(NO3)2水溶液(1.2 mmol·L-1)完成。每次加 3 μL，充分混勻后進(jìn)行紫外和熒光測(cè)試。

1.4 BDP-m-BPA對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)

探針對(duì)金屬離子選擇性熒光響應(yīng)能力測(cè)試及Zn2+在其他金屬離子存在下的競(jìng)爭(zhēng)性熒光響應(yīng)實(shí)驗(yàn)均在前述介質(zhì)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中向3 mL探針(10 μmol·L-1)溶液中加入 15 μL 濃度為 12 mmol·L-1的金屬離子水溶液 (金屬離子總濃度為探針濃度的6倍)，充分混勻后進(jìn)行測(cè)試。競(jìng)爭(zhēng)響應(yīng)研究中向3 mL探針 (10 μmol·L-1) 溶液中加入 15 μL 濃度為 12 mmol·L-1的Zn(NO3)2水溶液，充分混勻后記錄光譜。然后再向此溶液中加入15 μL濃度為12 mmol·L-1的其他金屬離子或6 μL濃度為1 mol·L-1的堿金屬或堿土金屬離子溶液，混勻后記錄光譜。

1.5 BDP-m-BPA的線性響應(yīng)范圍及檢測(cè)限測(cè)定

測(cè)試在含 1 μmol·L-1BDP-m-BPA 的 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)中進(jìn)行。向3 mL探針溶液中分別加入Zn2+水溶液(0.12 mmol·L-1)，每次加 3.0 μL，充分混勻后進(jìn)行熒光測(cè)試。檢測(cè)限測(cè)試先掃描背景11遍，獲得標(biāo)準(zhǔn)偏差σ。檢測(cè)限利用3σ/S求出，其中S為線性響應(yīng)范圍內(nèi)的斜率。

1.6 BDP-m-BPA量子產(chǎn)率的測(cè)定

配體溶液為 1 μmol·L-1的 Tris-HCl溶液(20 mmol·L-1，pH=7.20，VC2H5OH∶Vwater=1∶1)。羅丹明 B 作為為基準(zhǔn)物(Φf=0.97，C2H5OH)，把基準(zhǔn)物的吸光度和待測(cè)物激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度調(diào)整到0.1以下，以527 nm為共同激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)各溶液分別進(jìn)行紫外吸收測(cè)定與熒光光譜測(cè)定，結(jié)果取3次平均值。所得數(shù)據(jù)代如下列公式進(jìn)行計(jì)算[32]：

公式中F為熒光發(fā)射光譜的積分面積，A表示所用激發(fā)波長(zhǎng)的吸光度，n為樣品溶液的折射系數(shù)，下標(biāo)R與S分別代表基準(zhǔn)物與樣品。

1.7 BDP-m-BPA與Zn2+的結(jié)合常數(shù)測(cè)定

結(jié)合常數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)在含不同Zn2+濃度的溶液中進(jìn)行。溶液中探針BDP-m-BPA的濃度固定為10 μmol·L-1。BDP-m-BPA 的 Zn2+結(jié)合常數(shù)可根據(jù)下式進(jìn)行擬合[33]：

其中I0是不加Zn2+時(shí)BDP-m-BPA在580 nm處熒光強(qiáng)度，I是不同Zn2+濃度時(shí)BDP-m-BPA在580 nm處熒光強(qiáng)度。

1.8 BDP-m-BPA的胞內(nèi)分布和胞內(nèi)Zn2+造影

造影實(shí)驗(yàn)中所用HeLa細(xì)胞在含有10%胚胎小牛血清(FCS，Invitrogen)、青霉素(100 units·mL-1)和鏈霉素 (100 mg·mL-1) 的 Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境為37℃含5%CO2的空氣。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，去掉介質(zhì)后，細(xì)胞用不含金屬的PBS溶液洗滌3次。細(xì)胞染色及胞內(nèi)Zn2+成像實(shí)驗(yàn)步驟如下：把BDP-m-BPA乙醇儲(chǔ)備液稀釋到不含金屬的PBS溶液中，使其最終濃度為10 μmol·L-1。以此溶液室溫孵育HeLa細(xì)胞30 min。去除探針溶液后再用不含金屬的PBS溶液洗滌3次，然后用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行造影。細(xì)胞外源鋅的引入利用 ZnSO4/吡啶硫酮(10 μmol·L-1，通過(guò) PBS 稀釋相應(yīng)5 mmol·L-1儲(chǔ)備液獲得)溶液孵育30 min完成，隨后再次進(jìn)行熒光造影。造影完畢后，細(xì)胞再用50 μmol·L-1TPEN(由TPEN的濃儲(chǔ)液通過(guò) PBS稀釋得到)處理30 min后，再用PBS洗滌一次后進(jìn)行造影。造影均在Olympus IX81激光共聚焦熒光顯微鏡上完成。激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm,成像通道為560～590 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 BDP-m-BPA的Zn2+熒光和吸收光譜滴定

熒光光譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)自由BDP-m-BPA發(fā)射光譜顯示2個(gè)以575和660 nm為中心的發(fā)射峰，其中后一發(fā)射峰較寬。隨化合物濃度的增大，前一發(fā)射峰幾乎不變，而后一發(fā)射峰增強(qiáng)明顯，具有受激締合發(fā)射峰的特點(diǎn) (圖2)，在無(wú)α-(4-羥基)苯乙烯結(jié)構(gòu)的BODIPY熒光團(tuán)中無(wú)此發(fā)射峰，顯示該結(jié)構(gòu)的引入促進(jìn)了分子間的締合作用。前一發(fā)射峰可指認(rèn)為BODIPY母體的本征熒光發(fā)射。探針的激發(fā)光譜顯示化合物具有多個(gè)激發(fā)峰，其中以527 nm為中心的激發(fā)峰波長(zhǎng)較長(zhǎng)，激發(fā)效率適中且不與發(fā)射干擾，在后續(xù)光譜研究中被選為激發(fā)波長(zhǎng)。該探針的本征發(fā)射峰較普通BODIPY熒光團(tuán)紅移了近60 nm，而受激締合發(fā)射已靠近近紅外發(fā)射窗口。激發(fā)和發(fā)射的向紅變化，這與α-(4-羥基)苯乙烯結(jié)構(gòu)引入擴(kuò)展了共軛體系、促進(jìn)分子內(nèi)ICT效應(yīng)以及分子締合有關(guān)[26]，有利于降低造影中的自發(fā)熒光干擾和光毒性。另外本征發(fā)射的Stokes位移達(dá)到53 nm，也遠(yuǎn)大于普通BODIPY的Stokes位移(＜20 nm)。對(duì)受激締合發(fā)射發(fā)射來(lái)說(shuō)Stokes位移更達(dá)到133 nm。Stokes位移的增大也有利于減少激發(fā)光的干擾。除了300～450 nm間若干個(gè)小的吸收峰外，BDP-m-BPA的最大吸收峰出現(xiàn)在596 nm，相對(duì)摩爾吸光系數(shù)為6.30×104L·mol-1·cm-1。該吸收帶還存在一個(gè)位于566 nm的不明顯的肩峰。BDP-m-BPA在596 nm處的最大吸收峰可歸屬為ICT效應(yīng)導(dǎo)致的吸收峰，比較一般 meso-苯基-1，3，5，7-四甲基取代的 BODIPY的最大吸收(～500 nm)[34]，探針將近100 nm的吸收峰紅移同樣可以認(rèn)為源于α-位的對(duì)羥基苯乙烯基取代增強(qiáng)了分子的ICT效應(yīng)[26,30]。

圖2 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)中的熒光激發(fā)(λem=580 nm)和發(fā)射光譜(λex=527 nm)Fig.2 Excitation(λem=580 nm)and emission(λex=527 nm)spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VCH5OH ∶VH2O=1∶1)

圖3 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的熒光滴定圖譜Fig.3 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

在Tris-HCl溶液中的Zn2+熒光滴定結(jié)果表明(圖 3)，不斷加入 0.1 倍量的 Zn2+將導(dǎo)致 BDP-m-BPA發(fā)射光譜中相對(duì)較弱的575 nm處的發(fā)射峰不斷增強(qiáng)，并且出現(xiàn)微小的紅移。Zn2+的加入對(duì)其ICT發(fā)射峰影響不明顯。Zn2+對(duì)本征發(fā)射峰和ICT發(fā)射峰的不同影響顯示該化合物對(duì)Zn2+有一定的比例計(jì)量響應(yīng)行為。然而Zn2+加入量較大時(shí)本征發(fā)射峰增強(qiáng)后會(huì)導(dǎo)致與ICT發(fā)射峰明顯交疊，使得后者逐漸成為不明顯的肩峰，因此比例計(jì)量效應(yīng)受到干擾，探針主要體現(xiàn)Zn2+增強(qiáng)響應(yīng)。根據(jù)580 nm處探針熒光強(qiáng)度給出的Zn2+滴定曲線表明探針的熒光隨著Zn2+的加入持續(xù)增強(qiáng)，雖然熒光增長(zhǎng)率在加入6倍探針量的Zn2+后已較小，但未達(dá)平衡，這也表明Zn2+與探針的結(jié)合能力不強(qiáng)。在紫外光照射下BDP-m-BPA溶液發(fā)出紅色熒光，加入6倍探針量的Zn2+之后溶液立即轉(zhuǎn)為發(fā)出黃色熒光，這一現(xiàn)象也表明探針?lè)肿訉?duì)Zn2+的熒光識(shí)別可以通過(guò)肉眼觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖4)。研究表明探針?lè)肿釉?27 nm光源激發(fā)下的量子產(chǎn)率為0.023，而加入6倍Zn2+后可導(dǎo)致BDP-m-BPA的量子產(chǎn)率升高到約為0.16。

圖4 紫外燈照射下 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中對(duì) Zn2+的熒光響應(yīng)Fig.4 Photograph of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)uopon irradiation by UV lamp of 365 nm

Zn2+熒光滴定結(jié)果表明BDP-m-BPA與Zn2+結(jié)合主要誘導(dǎo)本征發(fā)射強(qiáng)度的增強(qiáng)并逐漸覆蓋基本不變的受激締合發(fā)射峰，BDP-m-BPA主要表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)型探針。一般在BODIPY衍生物中，meso-位芳環(huán)與BODIPY熒光團(tuán)既不共面也不共軛有關(guān)[35]，因此Zn2+離子與meso-芳香氨基配位并不會(huì)影響探針?lè)肿拥氖芗ぞ喓献饔谩Ｍ瑫r(shí)由于meso-芳香氨基與BODIPY的隔離使得BPA螯合團(tuán)對(duì)BODIPY存在PET淬滅效應(yīng)，因此Zn2+導(dǎo)致的探針本征熒光發(fā)射增強(qiáng)應(yīng)源于BPA與Zn2+配位阻斷PET效應(yīng)。

紫外滴定實(shí)驗(yàn)表明Zn2+的加入對(duì)596和566 nm兩處的吸收峰僅有非常微小的影響(圖5)。由于meso-位芳香取代基與BODIPY母體結(jié)構(gòu)既不共面也不參與共軛，因此Zn2+與meso-苯環(huán)對(duì)位BPA配位不會(huì)明顯影響B(tài)ODIPY母體中的ICT效應(yīng)。

圖5 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜滴定圖Fig.5 UV-Vis spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)obtained upon Zn2+titration in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)

2.2 BDP-m-BPA與Zn2+的結(jié)合方式

由于探針與Zn2+的結(jié)合能力較弱，不易通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光滴定曲線獲得Zn2+結(jié)合比例的有效信息。實(shí)際研究中首先通過(guò)測(cè)定Tris-HCl緩沖溶液中Zn2+與探針的熒光工作曲線來(lái)確定探針的Zn2+結(jié)合比例。固定BDP-m-BPA和 Zn2+的總濃度為 30 μmol·L-1，通過(guò)改變Zn2+與BDP-m-BPA的比例得到不同比值下體系的熒光光譜圖(圖6)。根據(jù)580 nm處熒光強(qiáng)度得到的工作曲線顯示熒光強(qiáng)度最大值出現(xiàn)在Zn2+與總濃度比值為0.5處。這一結(jié)果表明BDP-m-BPA與Zn2+是以1∶1的計(jì)量比結(jié)合的。

研究同時(shí)還用電噴霧質(zhì)譜對(duì)BDP-m-BPA與Zn2+的配合物進(jìn)行了研究。如圖7所示，等物質(zhì)的量混合的BDP-m-BPA和Zn2+混合液的正離子電噴霧質(zhì)譜顯示兩個(gè)主要信號(hào)峰，其最高豐度質(zhì)荷比分別為668.50和790.33。兩信號(hào)的同位素分布模式分別與ISOPRO 3.0給出的物種[BDP-m-BPA]+和[BDP-m-BPA+Zn2++AcO-]+的質(zhì)譜同位素分布模式基本一致，因此可將這兩個(gè)質(zhì)譜信號(hào)分別指認(rèn)為這兩個(gè)物種。該結(jié)果一方面證實(shí)探針BDP-m-BPA與Zn2+是以1∶1的計(jì)量比配位結(jié)合的，另一方面雖然電噴霧質(zhì)譜信號(hào)豐度不能完全對(duì)應(yīng)溶液中的濃度，但探針本身明顯的質(zhì)譜信號(hào)表明溶液中還存在較多的自由探針?lè)肿樱@也暗示探針與Zn2+的結(jié)合能力一般。

圖6 根據(jù)580 nm處熒光強(qiáng)度測(cè)定的BDP-m-BPA與Zn2+結(jié)合的工作曲線Fig.6 Job plot of BDP-m-BPA-Zn2+complex in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm upon excitation at 527 nm

圖7 BDP-m-BPA與Zn2+1∶1混合液的電噴霧質(zhì)譜圖Fig.7 ESI-MS spectrum of mixture solution of BDP-m-BPA and Zn2+(1∶1)

為測(cè)定BDP-m-BPA與Zn2+的結(jié)合常數(shù)，根據(jù)580 nm處的熒光強(qiáng)度研究中測(cè)定了探針結(jié)合Zn2+的BenesiHildebrand圖(圖8)。利用公式1對(duì)測(cè)得的BenesiHildebrand圖進(jìn)行線性擬合，獲得擬合直線的斜率和截距，由此計(jì)算得到 Ka值為～5.4×105L·mol-1(Kd，～1.8 μmol·L-1)。在已報(bào)道的以 BPA 為 Zn2+螯合團(tuán)的Zn2+探針中，以熒光素為熒光團(tuán)的NG-PDX的Kd值 30～40 μmol·L-1[36],以簡(jiǎn)單 BODIPY 為熒光團(tuán)的 BDA 的 Kd值為 0.1 nmol·L-1[37]，以七甲川菁為熒光團(tuán)的DPA-Cy的Kd值為60 nmol·L-1[18]。顯然不同的結(jié)構(gòu)組合可以導(dǎo)致BPA螯合團(tuán)具有不同的Zn2+結(jié)合能力。與BDA探針(BPA螯合團(tuán)氨基氮原子直接連接在meso-C位)相比，BDP-m-BPA中meso-位苯環(huán)與BPA氨基氮共軛，降低了其氨基的配位能力，也導(dǎo)致了整個(gè)分子的Zn2+結(jié)合能力降低。不過(guò)由于人體內(nèi)不同環(huán)境的自由Zn2+濃度范圍較大，從pmol·L-1一直跨到 300 μmol·L-1[1]，需要 Zn2+結(jié)合能力不同的探針來(lái)檢測(cè)不同濃度的Zn2+，而B(niǎo)DP-m-BPA正好可以滿足～μmol·L-1水平 Zn2+的檢測(cè)。

圖8 BDP-m-BPA在Tris-HCl緩沖液中(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH∶VH2O=1∶1)結(jié)合 Zn2+的 Benesi-Hildebrand圖;根據(jù)580 nm處熒光測(cè)定,激發(fā)波長(zhǎng)527 nmFig.8 Benesi-Hildebrand plot of BDP-m-BPA binding Zn2+in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)according to the emission at 580 nm;λex=527 nm

2.3 BDP-m-BPA對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)

BDP-m-BPA對(duì)不同金屬離子的熒光選擇性響應(yīng)能力如圖9所示。除Zn2+(6 equiv)對(duì)BODIPY本征發(fā)射峰有明顯的熒光增強(qiáng)響應(yīng)外，同族Cd2+和Hg2+(6 equiv)的熒光增強(qiáng)響應(yīng)非常微弱，而其他測(cè)試金屬離子 Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each) 以及Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each)均對(duì)探針的熒光光譜無(wú)明顯影響。Cu2+僅顯示對(duì)受激締合發(fā)射峰的淬滅效應(yīng)，對(duì)本征發(fā)射峰無(wú)明顯影響。這些結(jié)果表明該探針對(duì)Zn2+具有較好的特異性增強(qiáng)響應(yīng)能力。

為研究BDP-m-BPA在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)Zn2+的熒光檢測(cè)的能力，我們還測(cè)試了在其他金屬離子存在時(shí)探針對(duì)Zn2+的增強(qiáng)響應(yīng)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共存金屬離子如 Hg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Fe3+、Cr3+、Ag+(6 equiv each)以及 Na+、K+、Ca2+和 Mg2+(200 equiv each，圖 10中mix)均對(duì)探針的Zn2+熒光增強(qiáng)響應(yīng)無(wú)明顯干擾。Cu2+的存在導(dǎo)致Zn2+誘導(dǎo)的熒光增強(qiáng)效應(yīng)很小，這可能是由于Cu2+與BPA的結(jié)合能力較強(qiáng)，Cu2+、Zn2+共存時(shí)Zn2+與探針?lè)肿拥腂PA難以有效結(jié)合。以上結(jié)果表明BDP-m-BPA可以在含水溶液環(huán)境中對(duì)Zn2+實(shí)現(xiàn)熒光選擇性響應(yīng)。由于生命體系中“自由”Cu2+的濃度遠(yuǎn)低于“自由”Zn2+濃度，因此造影中不會(huì)對(duì)Zn2+檢測(cè)造成明顯的干擾。

圖9 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)在 Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)中對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng);Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+各自量是探針的 6倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,其中各離子的量為探針的200倍,λex=527 nmFig.9 Emission spectra of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH ∶VH2O=1∶1)in the presence of different metal cations;λex=527 nm

低濃度下(1 μmol·L-1)的鋅離子熒光滴定實(shí)驗(yàn)表明BDP-m-BPA在Tris-HCl緩沖溶液中對(duì)Zn2+的檢測(cè)限(LOD)為 0.18 μmol·L-1，其線性檢測(cè)范圍為0.12～1.2 μmol·L-1。由于人體自由鋅離子濃度范圍為 pmol·L-1到 0.3 mmol·L-1，目前顯示的檢測(cè)性能表明探針BDP-m-BPA具有合適的靈敏度和良好的線性響應(yīng)范圍，適合于～μmol·L-1水平自由Zn2+的檢測(cè)。

2.4 BDP-m-BPA熒光對(duì)pH的依賴性

圖10 金屬離子共存時(shí)Tris-HCl緩沖溶液(20 mmol·L-1,pH=7.20,VC2H5OH∶VH2O=1∶1)中 BDP-m-BPA(10 μmol·L-1) 對(duì) Zn2+的增強(qiáng)響應(yīng);Zn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Cr3+、Hg2+、Mn2+的含量是探針的 6 倍,Mix 是指 Na+、K+、Ca2+、Mg2+混合加入,各自含量分別是探針的200倍;I580,580 nm處熒光強(qiáng)度。黑色為探針加標(biāo)記金屬離子時(shí)數(shù)據(jù),灰色為探針加標(biāo)記金屬和Zn2+時(shí)數(shù)據(jù);Blank指探針及其加Zn2+時(shí)數(shù)據(jù)Fig.10 Fluorescent response of BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)in Tris-HCl buffer(20 mmol·L-1,pH 7.20;VC2H5OH ∶VH2O=1 ∶1)to Zn2+in the presence of other metal cations;Final concentration for Zn2+,Ag+,Pb2+,Cd2+,Co2+,Fe3+,Cr3+,Hg2+,Mn2+is 60 μmol·L-1each,for Mix,Na+,K+,Ca2+,and Mg2+were added simultaneously and the final concentration for each is 2 mmol·L-1;I580,emission at 580 nm;black bar,data in the presence of the indicated metal cation;gray bar,data in the presence of Zn2+and the indicated metal cation;Blank,the data for free sensor and sensor in the presence of Zn2+

為探討B(tài)DP-m-BPA在生物造影中的適用性，我們還進(jìn)一步研究了其熒光對(duì)pH的依賴性。為此分別測(cè)定試了探針在不同pH值的C2H5OH/H2O(1∶1，V/V)混合溶液中的熒光強(qiáng)度。圖11(a)顯示了探針在不同pH介質(zhì)中在580 nm處熒光強(qiáng)度。BDP-m-BPA 在 pH 7.0～12.4范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度較弱也比較穩(wěn)定。當(dāng)pH＜7.0時(shí)，探針的熒光隨pH降低略有增強(qiáng)，然而在pH6.0以上pH對(duì)熒光的影響仍然較小。在pH6.0以下pH降低誘導(dǎo)的熒光逐漸變得明顯，表明BPA氨基質(zhì)子化導(dǎo)致BPA對(duì)BODIPY熒光母體的PET淬滅效應(yīng)被阻止。上述pH熒光響應(yīng)行為表明該探針是一個(gè)PET探針，低pH值下氨基質(zhì)子化誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)是PET探針的典型表現(xiàn)[27]。正是BDP-m-BPA探針的PET型響應(yīng)特點(diǎn)導(dǎo)致Zn2+配位的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。BDP-m-BPA/Zn2+配合物在不同pH條件下的熒光測(cè)定 (圖11b)表明該配合物在pH 6.33～7.62范圍內(nèi)顯示相對(duì)穩(wěn)定的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，pH高于或低于該范圍則熒光強(qiáng)度迅速降低。由于在近中性條件下探針熒光及其Zn2+增強(qiáng)效應(yīng)無(wú)pH依賴性。而生命體內(nèi)大多數(shù)微環(huán)境的pH值不會(huì)偏離中性太多，因此在多數(shù)細(xì)胞和生物體微環(huán)境中BDP-m-BPA將顯示穩(wěn)定的熒光，不會(huì)干擾其Zn2+響應(yīng)，因此BDP-m-BPA應(yīng)較為適于細(xì)胞造影應(yīng)用。

圖11 (a)BDP-m-BPA(10 μmol·L-1)和(b)BDP-m-BPA/Zn2+配合物(10 μmol·L-1)在 580 nm 處熒光強(qiáng)度隨 pH變化圖(VC2H5OH∶VH2O=1∶1);激發(fā)波長(zhǎng)為 527 nmFig.11 Fluorescent pH titration profile according to the fluorescence intensity at 580nm;λex,527 nm

圖12 BDP-m-BPA染色的HeLa細(xì)胞的激光共聚焦造影圖;經(jīng)BDP-m-BPA染色（10 μmol·L-1in PBS,25℃,30 min）的細(xì)胞明場(chǎng)圖Fig.12 Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells stained by BDP-m-BPA(10 μmol·L-1in PBS,25 ℃,30 min)

2.5 BDP-m-BPA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Zn2+的造影性能

通過(guò)對(duì)探針染色的HeLa細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦熒光成像進(jìn)一步研究了BDP-m-BPA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Zn2+的造影能力。造影選用單通道模式完成，激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm，成像通道為560～590 nm。將HeLa細(xì)胞在BDP-m-BPA 溶液中(10 μmol·L-1)中 25 ℃下孵育 30 min，以PBS洗去探針溶液進(jìn)行細(xì)胞造影(圖12b)。熒光圖像顯示在細(xì)胞漿中存在點(diǎn)狀分布的熒光區(qū)域，一些靠近細(xì)胞核的區(qū)域具有更高強(qiáng)度的熒光。細(xì)胞核中未見(jiàn)明顯的熒光分布。未經(jīng)探針染色的細(xì)胞無(wú)論是胞漿還是細(xì)胞核中均未見(jiàn)明顯的熒光分布。這表明BDP-m-BPA探針具有良好的細(xì)胞膜透過(guò)能力，10 μmol·L-1溶液 25 ℃孵育 30 min 可以有效實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的染色。為確認(rèn)探針在細(xì)胞中對(duì)Zn2+的增強(qiáng)響應(yīng)，隨后分別研究了染色細(xì)胞在導(dǎo)入外源Zn2+和脫除Zn2+時(shí)的造影效果。外源Zn2+的導(dǎo)入是利用ZnSO4/吡啶硫酮(1∶1，10 μmol·L-1)溶液對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步孵化(30 min)實(shí)現(xiàn)的[38]。造影發(fā)現(xiàn)胞漿中熒光發(fā)生明顯增強(qiáng)(圖12c)，表明胞漿中探針?lè)肿涌捎行?duì)胞漿中Zn2+水平的提高做出響應(yīng)。熒光圖片還顯示細(xì)胞核中仍未有明顯熒光分布，而已有研究表明ZnSO4/吡啶硫酮孵育可以有效提高HeLa細(xì)胞核內(nèi)的自由Zn2+水平[39]，因此ZnSO4/吡啶硫酮孵育后核中無(wú)熒光表明BDP-m-BPA探針在核中沒(méi)有分布。負(fù)載有外源Zn2+的HeLa細(xì)胞的Zn2+脫除是利用具有胞內(nèi)金屬離子螯合能力的TPEN孵育完成的。熒光造影發(fā)現(xiàn)胞漿中熒光相比圖12c中熒光明顯降低(圖12d)，總體熒光強(qiáng)度甚至略低于圖12b中胞漿中熒光強(qiáng)度。這一結(jié)果不僅表明TPEN可有效降低胞漿中的自由Zn2+水平，同時(shí)也表明BDP-m-BPA在胞漿中可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Zn2+的可逆響應(yīng)。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)在BODIPY熒光團(tuán)的meso-位引入Zn2+螯合團(tuán)和α-位引入(4-羥基)苯乙烯基構(gòu)建了一個(gè)增強(qiáng)型Zn2+熒光探針BDP-m-BPA。探針?lè)肿语@示了特異性的 Zn2+熒光增強(qiáng)響應(yīng)，可在 0.12～1.2 μmol·L-1范圍內(nèi)線性響應(yīng)Zn2+。與普通BODIOY類(lèi)探針相比其激發(fā)和發(fā)射均出現(xiàn)了明顯的紅移 (激發(fā)紅移近～30 nm，發(fā)射紅移～70 nm)，同時(shí) Stokes位移達(dá)到～50 nm(本征發(fā)射)，有利于降低造影中的自發(fā)熒光干擾和光毒性，尤其有助于降低普通BODOPY類(lèi)探針由于Stokes位移小造成的激發(fā)干擾。熒光共聚焦造影表明BDP-m-BPA具有良好的細(xì)胞膜通透性，可對(duì)胞漿中自由Zn2+水平的變化實(shí)現(xiàn)可逆跟蹤。本研究不僅發(fā)展了一個(gè)新的BODIPY類(lèi)Zn2+熒光探針，而且表明α-(4-推電子基)苯乙烯取代是增強(qiáng)分子ICT效應(yīng)實(shí)現(xiàn)探針激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)向紅移動(dòng)和增大Stokes位移的有效手段，有望進(jìn)一步擴(kuò)大BODIPY類(lèi)熒光探針的應(yīng)用。

[1]Que E L,Domaille D W,Chang C J.Chem.Rev.,2008,108:1517-1549

[2]Vallee B L,Falchuk K H.Physiol.Rev.,1993,73:79-118

[3]Watt N T,Whitehouse I J,Hooper N M.J.Alzheimers Dis.,2010,2011:971021-971031

[4]Jayawardena R,Ranasinghe P,Galappatthy P,et al.Diabetol.Metab.Syndr.,2012,4:13-24

[5]Ho E,Song Y.Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care,2009,12:640-645

[6]Jiang P,Guo Z.Coordin.Chem.Rev.,2004,248:205-229

[7](a)Frederickson C J,Kasarskis E J,Ringo D,et al.J.Neurosci.Methods,1987,20:91-103(b)Nasir M S,Fahrni C J,Suhy D A,et al.J.Biol.Inorg.Chem.,1999,4:775-783(c)Hendrickson K M,Geue J P,Wyness O,et al.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:3889-3895

[8](a)Walkup G K,Burdette S C,Lippard S J,et al.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:5644-5645(b)Burdette S C,Walkup G K,Spingler B,et al.J.Am.Chem.Soc.,2001,123:7831-7841(c)Chang C J,Nolan E M,Jaworski J,et al.J.Chem.Biol.,2004,11:203-210(d)Burdette S C,Frederickson C J,Bu W,et al.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:1778-1787(e)Frederickson C J,Burdette S C,Frederickson C J,et al.J.Neurosci.Methods,2004,139:79-89(f)Nolan E M,Burdette S C,Harvey J H,et al.Inorg.Chem.,2004,43:2624-2635(g)Chang C J,Nolan E M,Jaworski J,et al.Inorg.Chem.,2004,43:6774-6779(h)Woodroofe C C,Masalha R,Barnes K R,et al.Chem.Biol.,2004,11:1659-1666(i)Nolan E M,Jaworski J,Racine M E,et al.Inorg.Chem.,2006,45:9748-9757

[9](a)Hirano,T,Kikuchi K,Nagano T.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:12399-12400(b)Hirano T,Kikuchi K,Nagano T.J.Am.Chem.Soc.,2002,124:6555-6562(c)Komatsu K,Kikuchi K,Kojima H,et al.J.Am.Chem.Soc.,2005,127:10197-10204

[10]Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:12399-12400

[11]Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2000,39:1052-1054

[12]Parkesh R,Clive Lee T,Gunnlaugsson T.Org Biomol.Chem.,2007,5:310-317

[13]Kim S Y,Hong J I.Tetrahedron Lett.,2009,50:2822-2824

[14]Zhao L Y,Mi Q L,Wang G K,et al.Tetrahedron Lett.,2013,54:3353-3358

[15]Mizukami S,Okada S,Kimura S,et al.Inorg.Chem.,2009,48:7630-7638

[16]Li J,Zhang C F,Ming Z Z,et al.Tetrahedron,2013,69:4743-4748

[17]Guo Z,Kim G H,Shin I,et al.Biomaterials,2012,33:7818-7827

[18]Tang B,Huang H,Xu K,et al.Chem.Commun.,2006:3609-3611

[19]Sasaki H,Hanaoka K,Urano Y,et al.Bioorg.Med.Chem.,2011,19:1072-1078

[20]Du P,Lippard S J.Inorg.Chem.,2010,49:10753-10755

[21]Sivaraman G,Anand T,Chellappa D.Analyst,2012,137:5881-5884

[22]Cao J,Zhao C,Wang X,et al.Chem.Commun.,2012,48:9897-9899

[23]Zhu S,Zhang J,Janjanam J,et al.J.Mater.Chem.B,2013,1:1722

[24]Zhang S,Wu T,Fan J,et al.Org.Biomol.Chem.,2013,11:555-558

[25]TIAN Mao-Zhong(田茂忠),PENG Xiao-Jun(彭孝軍),FAN Jiang-Li(樊江莉).Chin.J.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2006,34:S283-S288

[26]Rurack K,Kollmannsberger M,Daub J.Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40:385-387

[27]Qian F,Zhang C L,Zhang Y M,et al.J.Am.Chem.Soc.,2009,131:1460-1468

[28]Ashokkumar P,Ramakrishnan V T,Ramamurthy P.J.Phys.Chem.A,2011,115:14292-14299

[29]Peng X J,Du J J,Fan J L,et al.J.Am.Chem.Soc.,2007,129:1500-1501

[30]Bozdemir O A,Guliyev R,Buyukcakir O,et al.J.Am.Chem.Soc.,2010,132:8029-8036

[31]Dalpozzo R,De Nino A,Maiuolo L,et al.Aust.J.Chem.,2007,60:75-79

[32]Dutta B,Bag P,Florke U,et al.Inorg.Chem.,2005,44:147-157

[33]Chou C Y,Liu S R,Wu S P.Analyst,2013,138:3264-3270

[34]Gibbs J H,Robins L T,Zhou Z,et al.Bioorgan.Med.Chem.,2013,21:5770-5781

[35]Loudet A,Burgess K.Chem.Rev.,2007,107:4891-4932

[36]Gee K R,Zhou Z L,Ton-That D,et al.Cell Calcium.,2002,31:245-251

[37]Wu Y K,Peng X J,Guo B C,et al.Org.Biomol.Chem.,2005,3:1387-1392

[38]Liu Z,Zhang C,Chen Y,et al.Chem.Commun.,2012,48:8365-8367

[39]Zhang C,Liu Z,Li Y,et al.Chem.Commun.,2013,49:11430-11432