賽那瓦爾·芒思爾， 張 戈， 鄒國安， 阿吉艾克拜爾·艾薩

(中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建新疆特有藥用資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 烏魯木齊 830011)

駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap.)是豆科(Leguminosae)駱駝刺屬植物，具有開通阻滯、止咳祛痰、消除異常黏液質(zhì)等功效，用于治療腹痛腹脹、痢疾腹瀉、風(fēng)濕等癥[1]。駱駝刺提取物有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、降糖等藥理活性[2]。主要藥效活性成分為黃酮苷類化合物，其中異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷的量較多。自身可通過抑制α-淀粉酶降低血糖，并能抑制淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒[3-4]。

駱駝刺為維吾爾醫(yī)常用藥材。但因長期以來缺乏質(zhì)量控制用對照品，原藥材和各種復(fù)方成藥的質(zhì)量控制問題未得到解決。本實(shí)驗(yàn)以駱駝刺為原料, 采用制備高效液相色譜等分離方法制備化學(xué)對照品異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究, 為駱駝刺原藥材及復(fù)方成藥的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

戴安Ultimate TM3000系列液相色譜議包括LPG-3400RS泵系統(tǒng)、VWD-3100紫外檢測器、WPS-3000自動進(jìn)樣器和TCC-3000RS柱溫箱(Dionex, CAL. USA)，4000 QTRAP型三重四級桿-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀(ABI, USA)，Waters 全自動純化系統(tǒng)，2545型高壓二元泵，2489型紫外檢測器，3100型質(zhì)譜檢測器(Waters ,USA)。

色譜柱Inertsil ODS-SP, I.D.4.6 mm×250 mm, 4 μm (GL Sciences, Tokyo, Japan),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buch, SHZ-D),電子天平 (SEJ180-4)。色譜柱及薄層色譜板均為煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品， 甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑為分析純。

駱駝刺藥材2008年8月購買于新疆托克遜縣，經(jīng)中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所生物標(biāo)本館沈觀冕研究員鑒定為豆科駱駝刺屬植物駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap.)。

2 方法與結(jié)果

2.1原料處理取駱駝刺草藥材3 kg, 95%乙醇回流提取3次, 每次1 h, 合并醇提液, 減壓濃縮至浸膏狀(271 g), 加水混懸, 分別用石油醚、氯仿、乙酸乙醇及正丁醇萃取, 取正丁醇部位濃縮成浸膏(121 g), 加硅膠拌樣, 上樣于硅膠柱(200～300 目), 依次用氯仿-甲醇(90∶10～70∶30)、氯仿-甲醇-水(70∶30∶10～60∶40∶10)梯度洗脫，取氯仿-甲醇-水(70∶30∶10～60∶40∶10)的洗脫流份上樣于sephadex LH-20 柱, 甲醇洗脫, 合并黃酮苷富集流份，待制備行高相液相進(jìn)一步分離。

2.2色譜條件

2.2.1 制備型高效液相色譜條件 Waters C18 sunfireTM(300 mm× 25 mm, 6 m)，流動相為乙腈∶水(13∶87)，體積流量20 mL/min， 檢測波長254 nm，進(jìn)樣量300 μL( 5 mg/mL,MeOH) 。

2.2.2 對照品的制備分離 取異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷粗品加甲醇配制成5 mg/mL 的溶液, 制備高效液相色譜法多次進(jìn)樣分離純化, 每次進(jìn)樣量為300 μL, 收集保留時(shí)間為70 min 色譜峰(制備HPLC色譜圖見圖1), 減壓回收至干后置恒溫干燥箱(60℃)干燥10 h, 得到黃色無定性粉末。

圖1 乙腈-水13∶87為流動相比例分離圖譜

2.3樣品的檢測

2.3.1 薄層色譜檢測 取異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷自制品, 加甲醇配制成2 mg/ mL 的溶液, 點(diǎn)樣量分別為20 μg(點(diǎn)1)、40 μg(點(diǎn)2)、60 μg(點(diǎn)3)、80 μg(點(diǎn)4)，濃度依次增加，點(diǎn)樣于硅膠G 薄層色譜板，以15%硫酸乙醇溶液為顯色劑，其中硅膠G 薄層色譜展開劑分別為:氯仿-甲醇-水( 7∶3∶0.5)(圖2a)和丙酮-乙酸乙酯-水(8∶3∶1)(圖2b)，紫外光燈( 254 nm) 下檢視,在2種展開系統(tǒng)中均見單一黃色主成分斑點(diǎn), 無雜質(zhì)斑點(diǎn)。比移值分別為0.37和0.61。

2a 2b

2.3.2 HPLC-UV檢測 取異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷制品, 加甲醇配制成1 μg/mL 的溶液, Waters sunfireTM C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 流動相為乙腈∶水(80∶20),體積流量為1 mL/min，檢測波長為254 nm， 進(jìn)樣量為10 μL條件下面積歸一化法定量分析, 結(jié)果自制品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.01%, HPLC-UV百分含量檢查圖譜見圖3。

圖3 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷對照品HPLC譜圖

2.4結(jié)構(gòu)確定異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷為黃色粉末，易溶解于四氫呋喃，微溶于甲醇、水,難溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于石油醚。光譜分析結(jié)果如下：UVλMeOH max(logε)∶255 nm (1.15), 360 nm (0.83)， IR νmax cm-1:3 382，1 654，1 602，1 503，1 453。MS ESI-MSm/z(%):ESI-MS[M-H]-623。異鼠李素-3-O-蕓香糖苷對照品化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖4。自制異鼠李素-3-O-蕓香糖苷1H-NMR，13C-NMR信息和文獻(xiàn)報(bào)道的異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的1H-NMR、13C-NMR譜圖對比，結(jié)果一致(表1、2)。因此，推斷該化合物的分子式為C28H32O16。

圖4 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷對照品化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)數(shù)據(jù)歸屬

表2 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的13C-NMR(600 MHz,DMSO-d6) 數(shù)據(jù)歸屬

3 討論

初步的藥理實(shí)驗(yàn)研究亦表明，異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖是駱駝刺的主要有效成分之一，其事實(shí)上也是草本植物中分布普遍、比較常見的黃酮雙糖苷類化合物。本課題組選擇異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷為本植物特征性指標(biāo)成分并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究, 專屬性較強(qiáng), 具有質(zhì)量控制意義。采用硅膠富集結(jié)合凝膠柱色和制備高效液相從駱駝刺中制備異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷，樣品損失少，方法簡單，可快捷有效地得到異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷對照品，為駱駝刺藥材和復(fù)方制劑質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)；為實(shí)現(xiàn)維吾爾藥的現(xiàn)代化及與國際市場接軌服務(wù)，由此帶來可觀的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 劉墨祥，鄭毅男，劉日月，等. 旱柳葉中異鼠李素-3-蕓香糖甙和咖啡酸的分離與鑒定[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 29(1):9-12，22.