肖向文 朱奇朗 劉海峰 王俊鐸 羅城 曾聞梁亞軍 龔兆龍 李曉波

（1. 中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所 干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；2. 中國(guó)彩棉（集團(tuán)）股份有限公司，烏魯木齊830016；3. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091）

天然彩色棉作為環(huán)境友好型的純天然綠色產(chǎn)品，其纖維具有自然色彩，可省略化學(xué)染色，既節(jié)省生產(chǎn)成本，降低環(huán)境污染，又可避免紡織品中的化學(xué)染料對(duì)人體健康可能存在的某些不良影響，是真正意義上的“綠色、生態(tài)、環(huán)?！碧烊焕w維產(chǎn)品。彩棉紡織品被譽(yù)為“人類第二健康肌膚”、“天然的護(hù)膚品”，符合人們對(duì)衣著需求的發(fā)展趨勢(shì)和回歸自然的潮流，迎合了市場(chǎng)的需求，是21世紀(jì)國(guó)際綠色紡織品市場(chǎng)上最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品之一，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊［1-3]。近幾年經(jīng)過(guò)科研工作者的努力，選育出了一批產(chǎn)量、色澤、品質(zhì)等綜合性狀較優(yōu)的彩色棉新品種，在產(chǎn)量、抗性水平以及纖維品質(zhì)等方面取得了一定進(jìn)展，但彩色棉花一直存在著顏色單一、色譜狹窄、著色不均勻及色澤不穩(wěn)定等問(wèn)題，此外彩棉與白色棉相比，纖維品質(zhì)仍然有一定差距，這些因素都制約了彩棉的進(jìn)一步發(fā)展［4，5]。因此，提高彩棉的纖維品質(zhì)及獲得穩(wěn)定優(yōu)良的色澤特性，對(duì)于彩棉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

彩棉色素物質(zhì)是彩棉纖維中獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，此前的相關(guān)研究表明，彩棉色素物質(zhì)的合成同植物類黃酮合成途徑存在著密切關(guān)系［6]，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，開(kāi)展彩棉類黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆、表達(dá)特性研究及轉(zhuǎn)基因功能分析，對(duì)于揭示彩棉色素合成及調(diào)控的分子機(jī)制以及利用基因工程技術(shù)進(jìn)行彩棉纖維色彩及品質(zhì)的分子改良有著重要的意義。

類黃酮（flavonoids）是植物次生代謝產(chǎn)物，類黃酮化合物中的花青素等物質(zhì)是許多植物花、果實(shí)和種子色素的主要成分。迄今為止，在一些高等植物中，如擬南芥、玉米、矮牽牛等，有關(guān)類黃酮物質(zhì)合成途徑的主要步驟已基本探明［7]，類黃酮途徑已成為研究植物次生代謝基因表達(dá)及調(diào)控的模式途徑，也是植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標(biāo)。Xiao等［8]利用分子生物學(xué)方法，從棕色棉中分別克隆了類黃酮途徑中的5個(gè)關(guān)鍵酶基因查爾酮異構(gòu)酶（CHI），黃烷酮羥基化酶（F3H），二氫黃酮-4-還原酶（DFR），花青素合成酶（ANS），花青素還原酶（ANR）；通過(guò)RT-PCR 的方法檢測(cè)在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期這5個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明這幾個(gè)基因在棕色棉花中有較高的表達(dá)，而在白色和綠色棉花中表達(dá)量較低。此研究表明類黃酮途徑參與了彩色棉纖維中色素的合成。

為了研究DFR基因及類黃酮途徑在棕色棉纖維色素形成中的作用，本研究根據(jù)GenBank上登錄的棕色棉品種T586的DFR基因序列［5]設(shè)計(jì)引物，以新彩棉6號(hào)（XC-6）纖維的RNA以及DNA為模板克隆得到GhDFR基因的CDS全長(zhǎng)編碼序列及帶有內(nèi)含子的基因組序列。通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)GhDFR的氨基酸序列組成成分、理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域等方面進(jìn)行較為全面的分析。此項(xiàng)研究為探究DFR基因在棕色棉色素形成過(guò)程中的可能的功能及作用機(jī)制奠定前期理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后期利用基因工程的技術(shù)對(duì)彩色棉的色彩進(jìn)行遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選擇棕色棉品種新彩棉6號(hào)（XC-6）作為試驗(yàn)材料，2012年4月種植于新疆天然彩色棉花研究所實(shí)驗(yàn)基地，取開(kāi)花后（DPA）16 d的纖維。所取新鮮材料迅速放入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種、質(zhì)粒與試劑 大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pGEM-T Easy購(gòu)自Promega；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購(gòu)自天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子量Marker、ExTaqDNA聚合酶等購(gòu)自TaKaRa。引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第一鏈合成 基因組DNA的提取采用CTAB法［9]，總RNA提取方法參照熱硼酸/蛋白酶K法［10-12]，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量完好的RNA置-80℃保存?zhèn)溆?。DNaseⅠ消化殘留的DNA后，參照TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書以O(shè)ligo（dT）18為引物，使用M-MLV、37℃ 溫浴2 h，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得cDNA第一條鏈。

1.2.2GhDFR基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank登錄的序列EF187441，利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，F(xiàn)P（Forward Primer）：5'-GGTCTTTCTTTATGCCAAC-TG-3'，RP（Reverse Primer）：5'-GACATGGGTAGGCACTCAATT-3'。PCR的擴(kuò)增體系為20 μL，包括10×PCR Buffer 2 μL，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，模板cDNA（或基因組DNA）約50 ng，上下游引物各0.2 μmol/L，1 U Ex Taq DNA聚合酶（寶生物）。擴(kuò)增程序：95℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用天根公司的膠回收試劑盒回收DNA，連入Promega 公司pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與生物信息學(xué)軟件 應(yīng)用ExPASy工具包（http：//expasy.org/tools/）中的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析GhDFR氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)。利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在線預(yù)測(cè)DFR蛋白的親水性/ 疏水性。應(yīng)用PSORTII Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位。SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。序列相似性搜索用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast完成（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。DFR核苷酸和氨基酸序列的同源性多重比對(duì)用DNAMAN完成。Pfam 27.0（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和NCBI的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）在線預(yù)測(cè)DFR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。利用Clustal X軟件（http：//bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/）對(duì)基因組序列進(jìn)行相似性比較，MEGA軟件（http：//www.megasoftware.net/）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 GhDFR基因的克隆與測(cè)序

核苷酸序列的測(cè)定結(jié)果如圖1，圖2，所克隆獲得的GhDFR基因組序列為1 620 bp，CDS序列的長(zhǎng)度為1 068 bp，編碼355個(gè)氨基酸。序列結(jié)果已經(jīng)提交GenBank，登錄號(hào)為：KF749429。根據(jù)核苷酸序列測(cè)定結(jié)果，利用生物信息學(xué)與比較基因組學(xué)的方法，推測(cè)出該基因基因組序列有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子以GT開(kāi)始并以AG結(jié)尾的序列，而且3'端富含嘧啶核苷酸，基本符合內(nèi)含子的類型。新彩棉6號(hào)中克隆的GhDFR基因CDS編碼區(qū)與克隆自彩棉品種T586的GhDFR基因EF187441的CDS編碼序列完全相同，與GenBank中已經(jīng)登錄的FJ713480序列相比，其編碼區(qū)在5'端多出15個(gè)氨基酸編碼序列。內(nèi)含子可能是提高基因表達(dá)的一種原因，通過(guò)分析基因內(nèi)部?jī)?nèi)含子的組成，對(duì)理解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有非常重要的意義。內(nèi)含子還可以作為來(lái)研究物種進(jìn)化的分子標(biāo)記。

2.2 GhDFR編碼產(chǎn)物與其他植物GhDFR同源性比較

利用DNAMAN軟件將得到的GhDFR基因所編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的其他物種DFR的氨基酸序列完全比對(duì)，結(jié)果如圖3，發(fā)現(xiàn)該基因與圓葉葡萄VrDFR、毛果楊PtrDFR、葡萄VvDFR、天竺葵PzDFR、槿麻TcDFR、芍藥PlDFR、甜櫻桃PaDFR的氨基酸同源性較高，分別為80.8%、80.2%、79.6%、80.6%、79.0%、79.3%、76.9%，與擬南芥DFR同源性為72.7%。在GhDFR 蛋白質(zhì)序列N端存在21個(gè)氨基酸殘基的 NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)“VTGGSGFIGSWLIKLLLERGY”，該序列在不同植物中具有一定的保守性，另外還存在一個(gè)由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的底物特異性結(jié)合保守區(qū)域“TIDVAEQQKPCYDETCWSDLEFIQAK”，決定其底物的特異性［13，14]。NCBI的BLAST比對(duì)結(jié)果表明，DFR 蛋白屬于NADB-Rossmann超基因家族（NADBRossmann super-family）。

2.3 GhDFR氨基酸序列的理化性質(zhì)

ProtParam分析得出：GhDFR蛋白的理論分子量為39.65 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.67，其中Lys最多，有32個(gè)，占9.0%。其次為L(zhǎng)eu，有29個(gè)，占8.2%。而Tyr較少只有7個(gè)，占2.0%。最少的是Trp僅有5個(gè)，占1.4%。其中帶負(fù)電荷的氨基酸有48個(gè)，帶正電荷的氨基酸有40個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為35.88，是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)較高達(dá)到了85.15，這是因?yàn)镚hDFR基因的蛋白含有較多的Leu。總的平均親水值Grand average of hydropathicity（GRAVY）為-0.168，是親水性蛋白。

圖1 GhDFR基因的全長(zhǎng)序列及推斷的氨基酸序列

圖2 GhDFR內(nèi)含子及外顯子分析

2.4 GhDFR的親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)親水性/ 疏水性的預(yù)測(cè)是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及功能域劃分的重要的過(guò)程。ProtScale的分析結(jié)果（圖4）表明GhDFR蛋白的親水性/ 疏水性的最大值為208位的脯氨酸2.378，最小值為265位的丙氨酸-2.478，親水/ 疏水趨勢(shì)圖形也基本一致，結(jié)果如圖4所示。總體而言，與前面所有氨基酸序列理化性質(zhì)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，GhDFR蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 GhDFR與其他物種DFR基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)

SignalP的分析結(jié)果（圖5）表明GhDFR蛋白不具有信號(hào)肽，說(shuō)明GhDFR蛋白不是一個(gè)分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction 對(duì)GhDFR蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，GhDFR定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最高，為43.5%；其次為線粒體的26.1%，細(xì)胞核8.7%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)8.7%，最低為分泌囊泡、高爾基體和過(guò)氧化物酶體，可能性均為4.3%。

2.5 GhDFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

SOPMA對(duì)GhDFR進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖6），共有α-螺旋（Alpha helix）133處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的37.46 %，延伸鏈（Extended strand）50處，占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的14.08%，β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）26處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的7.32%，無(wú)規(guī)卷曲（Random coil）146處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的41.13%。該蛋白中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件，分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖4 GhDFR蛋白的親水性/疏水性分析

圖5 GhDFR蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Pfam27.0預(yù)測(cè)GhDFR蛋白的結(jié)構(gòu)域的結(jié)果（圖7）表明，GhDFR蛋白只有一個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，即NAD dependent epimerase/dehydratase family，與NCBI的CDD在線預(yù)測(cè)結(jié)果一樣，都證實(shí)了GhDFR 屬于NADB-Rossmann superfamily。

2.6 GhDFR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用Clustalx1.83軟件將編碼的氨基酸序列及從GenBank獲取的其他植物的DFR基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，然后利用 MEGA5.2軟件按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖8所示，途中所示數(shù)字為相對(duì)遺傳距離。GhDFR與天竺葵PzDFR蛋白以及芍藥PlDFR的親緣關(guān)系最近，可以聚為一類，與擬南芥AtDFR親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

圖6 GhDFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖7 GhDFR 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

圖8 GhDFR與其他高等植物 DFR蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

花色苷合成的類黃酮途徑是研究的最為清楚的植物次生代謝途徑之一［7]，類黃酮類化合物是植物花青素的主要成分，是花卉、果實(shí)、種皮重要的成色物質(zhì)。DFR即二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase）屬于細(xì)胞色素P450家族，是類黃酮/花青素生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，在類黃酮途徑中，DFR催化二氫黃酮醇，如二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)，分別生成無(wú)色天竺葵素、無(wú)色矢車菊素和無(wú)色飛燕草素（翠雀素），這些產(chǎn)物都是合成有色的花色苷類物質(zhì)的前體物質(zhì)［7，13]。從O’Reilly第一次克隆得到DFR基因開(kāi)始，利用同源克隆的方法分別在矮牽牛（Petunia hybrida）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、金魚(yú)草（Antirrhinum majus）、番茄（Lycopersicon esculentum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria ananassa）、玉米（Zea mays）等物種中都已經(jīng)克隆出來(lái)，其分子特征和調(diào)控機(jī)制已在很多植物中得到深入研究，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同物種的DFR有非常高的同源性，但是不同植物的DFR結(jié)合底物的特異性有所不同。在矮牽牛中，DFR優(yōu)先轉(zhuǎn)化DHM生成無(wú)色翠雀素，其次是DHQ，不能轉(zhuǎn)化DHK，因此矮牽牛中缺乏天竺葵色素，將玉米的DFR基因A1轉(zhuǎn)化矮牽牛，A1能夠催化DHK生成無(wú)色天竺葵素，進(jìn)而在花青素合成酶（ANS）的作用下生成桔紅色的天竺葵素，矮牽牛花色由淡紅色變?yōu)榻奂t色［14]。關(guān)于底物選擇特異性的分子機(jī)理，Beld等［15]根據(jù)對(duì)矮牽牛DFR的研究提出了一個(gè)由26個(gè)氨基酸組成的底物特異性結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域的氨基酸序列決定DFR對(duì)底物的特異性結(jié)合。隨后，Johnson等［16]利用DFR單氨基酸突變體證明改變底物特異性結(jié)合區(qū)域的某些氨基酸能夠改變矮牽牛DFR的底物特異性，而有些位置的氨基酸具有高度保守性，并確定了與底物特異性直接相關(guān)的幾個(gè)氨基酸殘基，如133位、134位、142位和145位，其中第134位氨基酸直接決定底物特異性，矮牽牛DFR第134位是Asp，其最佳底物為DHM，對(duì)DHQ的還原效率很低，不能以DHK為底物生成天竺葵素，其他134位是Asn的植物都能以DHK為底物。將矮牽牛134位的Asp替換為L(zhǎng)eu，則DFR從只以DHQ和DHM為底物變?yōu)閮?yōu)先轉(zhuǎn)化DHK，而不能有效轉(zhuǎn)化DHM。根據(jù)DFR蛋白該相應(yīng)位置氨基酸殘基不同，發(fā)現(xiàn)植物DFR分為幾種類型，即Asn型、Asp型及非Asn/Asp型，在植物中Asn型DFR分布廣泛，單子葉植物都是Asn型DFR，而Asp型DFR只分布在矮牽牛等部分雙子葉植物中。此外，只有少數(shù)植物含有非Asn/Asp型。根據(jù)蛋白比對(duì)結(jié)果，本研究克隆得到的棉花GhDFR屬于第二種類型（即Asp類型），推測(cè)其不能以DHK為底物生成無(wú)色天竺葵素，但目前還沒(méi)有關(guān)于棉花中花青素組成成分的報(bào)道。

內(nèi)含子是在轉(zhuǎn)錄后的加工中，從最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除去的內(nèi)部的核苷酸序列。內(nèi)含子可能含有“舊碼”，就是在進(jìn)化過(guò)程中喪失功能的基因部分。正因?yàn)閮?nèi)含子對(duì)翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)無(wú)意義，它比外顯子累積有更多的突變。但越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)含子在基因的表達(dá)與調(diào)控中起著非常大的作用。擬南芥、矮牽牛和金魚(yú)草等雙子葉植物的DFR基因都由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，而且它們的內(nèi)含子位置都大致相同［17]。本研究從棉花中得到的GhDFR基因的DNA序列也是由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上具有一定的保守性，這類基因可能具有較為重要的功能。

目前關(guān)于DFR在類黃酮/花青素合成途徑中的作用及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面已有較多研究，影響DFR基因表達(dá)的因素可分為兩類：內(nèi)部因素（各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如MYB、bHLH和WD40蛋白等）和外界因素（如光照、溫度等環(huán)境誘導(dǎo)因素），但目前對(duì)彩色棉類黃酮/花青素相關(guān)方面的研究還很少。本研究從彩棉D(zhuǎn)FR基因入手，利用生物信息學(xué)手段對(duì)棉花GhDFR基因的相關(guān)蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了初步研究，為將來(lái)研究彩色棉類黃酮/花青素生物合成以及利用基因工程技術(shù)進(jìn)行彩棉種質(zhì)資源的創(chuàng)新奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從棕色棉中克隆到GhDFR基因的全長(zhǎng)編碼序列及內(nèi)含子序列，該基因含有6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，其編碼的氨基酸序列包含具有高度保守性的NADP（H）的結(jié)合位點(diǎn)以及底物特異性結(jié)合位點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明其與天竺葵、芍藥的DFR親緣關(guān)系較近。

［1] 鄧福軍, 陳謙, 湯振江, 張哲鋒. 彩色棉的科研現(xiàn)狀與發(fā)展前景（上）［J] . 世界農(nóng)業(yè), 2005（1）：48-50.

［2] 鄧福軍, 陳謙, 湯振江, 張哲鋒. 彩色棉的科研現(xiàn)狀與發(fā)展前景（下）［J] . 世界農(nóng)業(yè), 2005（2）：42-44.

［3] 楊伯祥, 周宜軍, 王冶斌. 彩色棉主要經(jīng)濟(jì)性狀研究［J] . 中國(guó)棉花, 1999, 26（1）：9-10.

［4] 杜雄明, 石玉真. 天然彩色棉纖維特性及開(kāi)發(fā)利用［J] . 針織工業(yè), 2002（1）：29-33.

［5] 孫東磊, 孫君靈, 杜雄明, 馬峙英. 彩色棉種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)鑒定與分析［J] . 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2008, 9（4）：469-474.

［6] Hua SJ, Wang XD, Zhao XQ, et al. Dynamics of carbohydrate and pigment content during fiber development in brown-colored cotton［J] . Cotton Science, 2008, 20（3）：239-241.

［7] Nishihara M, Nakatsuka T. Genetic engineering of flavonoid pigments to modify flower color in floricultural plants［J] . Biotechnology Letters, 2011, 33：433-441.

［8] Xiao YH, Zhang ZS, Yin MH, et al. Cotton flavonoid structural genes related to the pigmentation in brown fibers［J] . Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 358（1）：73-78.

［9] Paterson AH, Brubaker CL, Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton（Gossypiumspp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis［J] . Plant Molecular Biology Reporter,1993, 11：122-127.

［10] Wan CY, Wilkin TA. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton（Gossypium hirsutumL.）［J] . Analytical Biochemistry, 1994, 223：7-12.

［11] 梁明煒, 劉海峰, 陸雪瑩, 等. 棕色棉類黃酮 3'-羥化酶基因（F3'H）的克隆及色素合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)特性研究［J] .農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 19（5）：808-814.

［12] 宋洋, 吳巧雯, 郭三堆. 制備棉花幼蕾高質(zhì)量總RNA的方法比較［J] . 棉花學(xué)報(bào), 2008, 20（3）：231-234.

［13] Holton TA, Cornish EC. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis［J] . The Plant Cell, 1995, 7：1071-1083.

［14] Meyer P, Heidmann I, Forkmann G, Saedler H. A new petunia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene［J] . Nature, 1987, 330（6149）：677-678.

［15] Beld M, Martin C, Huits H, et al. Flavonoid synthesis inPetunia hybrida：partial characterization of dihydroflavonol-4-reductase genes［J] . Plant Molecular Biology, 1989, 13：491-502.

［16] Johnson ET, Ryu S, Yi HK, et al. Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase［J] .Plant Journal, 2001, 25：325-333.

［17] Inagaki Y, Johzuka-Hisatomi Y, Mori T, et al. Genomic organization of the genes encoding dihydroflavonol 4-reductase for flower pigmentation in the Japanese and common morning glories［J] .Gene, 1999, 226：181-188.