張杰偉 管陽 朱丹 陳亞娟 丁莉萍 王宏芝 魏建華

（北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

真核細(xì)胞翻譯起始因子5A（eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A）是真核生物中普遍存在的一類蛋白，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一含有羧腐胺賴氨酸殘基的蛋白［1]。羧腐胺賴氨酸是由eIF5A翻譯后特定位置的賴氨酸經(jīng)兩步酶促反應(yīng)催化生成［2]，被修飾后的eIF5A才能夠在生物體內(nèi)行使功能［3]。eIF5A最初被認(rèn)為在蛋白翻譯起始起重要作用，但最近的研究表明，其在所有細(xì)胞中蛋白延伸過程中發(fā)揮著重要作用［4，5]。Gutierrez等［6]利用酵母和體外模擬翻譯試驗(yàn)表明，eIF5A不僅能增強(qiáng)核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，而且能提高酶與作用底物的反應(yīng)性，從而在促進(jìn)連續(xù)脯氨酸殘基間的多肽聯(lián)合的形成過程中起著重要作用。在植物細(xì)胞中，eIF5A參與了植物的生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫等生理過程［3，7]。如擬南芥中，eIF5A翻譯后修飾關(guān)鍵酶——脫氧羧腐胺賴氨酸合酶（Deoxyhypusine synthase，DHS）抑制其活性后可延緩葉片衰老過程［1]，AteIF5A1參與擬南芥次生木質(zhì)部的發(fā)生過程［2]，AteIF5A2參與擬南芥病原菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，AteIF5A3參與擬南芥的生長發(fā)育過程［8]。月季RceIF5A響應(yīng)高溫、滲透和氧化脅迫。過量表達(dá)RceIF5A的轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型更加耐受滲透、過氧化和高溫脅迫，而減量表達(dá)RceIF5A轉(zhuǎn)基因擬南芥（擬南芥中所有eIF5A成員表達(dá)均下調(diào)）在滲透、過氧化和高溫脅迫時較野生型更敏感［9]。楊樹中過表達(dá)檉柳TaeIF5A1基因，在正常的生長條件下轉(zhuǎn)基因與野生型楊樹生長狀態(tài)沒有明顯區(qū)別，但在0.6%的NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因楊樹的株高和底面直徑均比野生型高；且在山梨醇、硫酸銅和氯化鉻等非生物脅迫下，轉(zhuǎn)基因楊樹均表現(xiàn)明顯的耐受［3]。

我國現(xiàn)有楊樹人工林757萬hm2，因其生長速度快，基因組相對較小已成為林木研究的模式植物。在前期研究中，研究組從毛白楊中克隆了1個eIF5A基因的全長cDNA，依據(jù)其與已測序完成的毛果楊序列的同源性分析，將其命名為PtoeIF5A4。該基因在毛白楊不同組織中表達(dá)豐度不同，其在莖中的表達(dá)量最高，其次為葉片和根。根據(jù)PtoeIF5A4在毛白楊莖中的表達(dá)模式，推測其在林木次生生長中起關(guān)鍵作用［10]。為了進(jìn)一步研究該基因在林木次生生長過程中的功能，本試驗(yàn)旨在通過構(gòu)建已克隆的毛白楊PtoeIF5A4的原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)獲得較高純度的蛋白，以期為進(jìn)一步分析該蛋白特性和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 攜帶PtoeIF5A4全長cDNA的質(zhì)粒pGEM-T Easy-PtoeIF5A4為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；大腸桿菌BL21（DE3）、TOP10感受態(tài)細(xì)胞及原核表達(dá)載體pET-28a（+）為農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 T4 DNA連接酶購自美國NEB公司、Phusion DNA聚合酶購自美國Thermo公司；pGEM-T Easy載體快速連接試劑盒和DNA片段快速純化/回收試劑盒購自美國Promega公司；限制性內(nèi)切酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量Marker購自加拿大Fermentas公司。親和填料Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow購自美國GE公司；一抗鼠抗Histidine單克隆抗體購自美國Sigma公司；二抗辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG購自中山金橋公司；顯色底物購自瑞士Roche公司；X光片購自日本Kodak公司。IPTG、卡那霉素、氨芐青霉素其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 毛白楊PtoeIF5A4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用DNAMAN軟件分析PtoeIF5A4cDNA編碼區(qū)的酶切位點(diǎn)分布，結(jié)合表達(dá)載體pET28a（+）多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計擴(kuò)增PtoeIF5A4基因進(jìn)行原核表達(dá)的上游引物PtoeIF5A4-F（5'-CATATGTCGGACGAGGAGCACC-3'）和下游引物PtoeIF5A4-B（5'-GTCGACTCAATTTTTTGGACCA-3'），分別在PtoeIF5A4的5'端和3'端引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。以實(shí)驗(yàn)室保存的pGEM-T Easy-PtoeIF5A4的質(zhì)粒為模板，用Phusion DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：5×Phusion HF緩沖液（Mg2+）4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2 U/μL Phusion DNA聚合酶0.1 μL，10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 10.3 μL。擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72℃總延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收480 bp的目的條帶并克隆到pBSK載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，提取陽性克隆質(zhì)粒，用NdeⅠ和SalⅠ雙酶切檢測質(zhì)粒并送上海生工生物工程公司測序。分別用NdeⅠ和SalⅠ雙酶切測序正確的pBSK-PtoeIF5A4和pET28a（+）載體質(zhì)粒，并回收480 bp和5 kb的目的條帶。

分別取回收后的目的片段及載體片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有Kan（50 μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基，37℃溫箱過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定后用于表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化。

1.2.2 PtoeIF5A4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-PtoeIF5A4轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Kan的固體LB培養(yǎng)基上，37℃溫箱過夜培養(yǎng)，挑取重組質(zhì)粒的單克隆菌落經(jīng)菌落PCR鑒定后，選取單菌落接種于5 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。取上述過夜菌液1 mL轉(zhuǎn)接入不同100 mL含Kan的液體LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD為0.6-0.8時，分別加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L，28℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，同時設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對照。取1 mL誘導(dǎo)后菌液，6 000 g，離心10 min后收集菌體，分別用60 μL和90 μL 1×PBS 緩沖液（20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L NaCl，pH7.4）重懸，分別加入4×SDS上樣緩沖液20 μL和30 μL，煮沸10 min，13 000 g離心3 min，取上清10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。1.2.3 PtoeIF5A4重組蛋白的純化及電泳 每100 mL菌液收集的菌體中加入2 mL含1 mmol/L PMSF的1×PBS 緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎（輸出功率270 W，每超聲20 s，間隔40 s，共15次）。4℃、13 000 g離心30 min，小心吸出上清液至另一離心管中。鎳親和填料按說明書進(jìn)行處理及活化后，取1 mL裝柱。用超聲后離心的上清液2 mL上樣，依次用5 mL洗脫液1（1×PBS 緩沖液＋20 mmol/L咪唑），5 mL洗脫液2（1×PBS 緩沖液＋200 mmol/L咪唑）洗滌，5 mL洗脫液3（1×PBS 緩沖液＋500 mmol/L咪唑）洗滌，每管收集500 μL，12% SDSPAGE電泳檢測各管蛋白并用考馬斯亮藍(lán)R250染色。1.2.4 PtoeIF5A4重組蛋白的免疫印跡 蛋白質(zhì)免疫印跡參照Laemmli［11]的方法進(jìn)行。采用Bio-Rad半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，13 V轉(zhuǎn)移30 min。轉(zhuǎn)移蛋白后的PVDF膜經(jīng)過麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)移效果。

轉(zhuǎn)移蛋白后的PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20，pH7.5）中室溫封閉2 h；然后在含有0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中加入一抗Anti-His（1∶10 000稀釋），4℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，100 mL/次，10 min/次；然后在含有0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中加入二抗山羊抗鼠（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h；繼續(xù)用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，100 mL/次，10 min/次；取出PVDF膜用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯色5 min，在暗室中對X光片曝光。

2 結(jié)果

2.1 重組原核表達(dá)載體pET28-PtoeIF5A4的構(gòu)建與鑒定

以攜帶毛白楊PtoeIF5A4編碼區(qū)（PtoeIF5A4-CDS）的質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增首先在PtoeIF5A4-CDS的5' 與3' 端分別添加NdeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，獲得480 bp的片段（圖1）。PtoeIF5A4-CDS中沒有NdeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，同時在pET28a（+）的多克隆位點(diǎn)又存在這兩個位點(diǎn)，因此，可將PtoeIF5A4-CDS克隆到pET28a（+）的這兩個酶切位點(diǎn)之間，得到N端融合有組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）的融合蛋白。

圖 1 PtoeIF5A4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將添加酶切位點(diǎn)的PtoeIF5A4-CDS克隆到pBSK載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑取陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒（pBSK-PtoeIF5A4），經(jīng)酶切鑒定及測序選擇與原序列完全一致的陽性克隆，提起質(zhì)粒，分別用NdeⅠ和SalⅠ雙酶切pBSK-PtoeIF5A4及pET28a（+）載體，分別回收480 bp和5 kb的條帶進(jìn)行連接，將菌落PCR鑒定為陽性的4個重組子再進(jìn)行雙酶切鑒定，2個重組子經(jīng)酶切鑒定后均得到兩條目的帶，大約為5 kb和480 bp（圖2），恰好與預(yù)期的pET28a（+）載體和PtoeIF5A4片段的大小相符，說明已成功構(gòu)建了毛白楊PtoeIF5A4的原核表達(dá)載體，命名為pET28-PtoeIF5A4。

2.2 pET28-PtoeIF5A4在BL21中的表達(dá)

圖 2 酶切鑒定重組質(zhì)粒pET28-PtoeIF5A4

將構(gòu)建好的pET28-PtoeIF5A4轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），挑取轉(zhuǎn)化菌斑5個，用基因特異性引物（PtoeIF5A4-F和PtoeIF5A4-B）進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。選取鑒定正確的單菌落在37℃條件下振蕩培養(yǎng)菌液至OD600為0.6-0.8時，在28℃條件下，分別用0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，然后SDS-PAGE檢測未誘導(dǎo)及不同IPTG濃度誘導(dǎo)后的總蛋白，在0.1和0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)后總蛋白在18 kD處明顯比未誘導(dǎo)總蛋白的量大，其中0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時該蛋白表達(dá)最多，而在0.5和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)后總蛋白在18 kD處僅比未誘導(dǎo)總蛋白的量略多（圖3），該蛋白的大小與PtoeIF5A4的預(yù)測大小一致，初步推測誘導(dǎo)出的18 kD蛋白為目的蛋白。

圖 3 不同IPTG濃度pET28-PtoeIF5A4的表達(dá)分析

2.3 毛白楊pET28-PtoeIF5A4原核表達(dá)與純化

因pET28-PtoeIF5A4重組蛋白在28℃條件下，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的表達(dá)量最高，故選取該條件進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，4℃收集菌體用1×PBS緩沖液重懸后經(jīng)超聲破碎菌體并離心后用12%的SDSPAGE電泳檢測，在上清和包涵體部分均在18 kD處有一條明顯的蛋白條帶，用洗脫液2洗脫Ni2+親和層析柱時可以從上清中純化出18 kD的目的蛋白，且純度大于95%（圖4-A），Western blotting可見該重組蛋白能夠與Anti-His單克隆抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)（圖4-B），表明該純化蛋白為融合有His標(biāo)簽的PtoeIF5A4。

圖 4 pET28-PtoeIF5A4的純化（A）及（B）鑒定

3 討論

本試驗(yàn)選用了pET原核表達(dá)系統(tǒng)，pET28a載體上的T7啟動子與大腸桿菌BL21（DE3）中噬菌體編碼的T7 RNA聚合酶特異結(jié)合，從而高效地啟動下游目的基因的表達(dá)［12，13]。本研究中，構(gòu)建的表達(dá)載體pET28a-PtoeIF5A4經(jīng)序列測定表明，PtoeIF5A4基因插入位置、大小和讀碼框均正確，試驗(yàn)結(jié)果表明pET28-PtoeIF5A4融合蛋白在宿主菌能被正常表達(dá)。該載體帶有His標(biāo)簽蛋白（6個組氨酸標(biāo)記），可與目的蛋白的N 末端或C 末端形成融合蛋白，便于用組氨酸-Ni2+親合層析法純化目的蛋白，因此在本研究中選用了pET28a表達(dá)載體來表達(dá)楊樹PtoeIF5A4蛋白，在PtoeIF5A4基因上游引物的起始密碼子ATG 前引入了NdeⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物的終止密碼子后引入SalⅠ酶切位點(diǎn)。因此表達(dá)的蛋白質(zhì)的N端含有6個組氨酸標(biāo)簽，本研究中，pET28-PtoeIF5A4融合蛋白經(jīng)超聲離心后上清可通過Ni2+親和層析柱快速、簡便和高效的純化。本試驗(yàn)通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)表達(dá)的融合蛋白相對分子質(zhì)量為18 kD，與PtoeIF5A4預(yù)測分子量一致，Western blotting試驗(yàn)證明該重組蛋白能夠與Anti-His單克隆抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，表明本研究已經(jīng)成功表達(dá)并純化PtoeIF5A4融合蛋白。

前期的研究表明，IPTG 的濃度對外源蛋白的表達(dá)有著重要的影響，但是過高濃度的IPTG 往往對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，同時也影響融合蛋白的表達(dá)效率和表達(dá)形式。本試驗(yàn)探索了不同濃度的IPTG對PtoeIF5A4融合蛋白表達(dá)的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，在未加入IPTG時，PtoeIF5A4融合蛋白已有輕微的表達(dá)，當(dāng)IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，PtoeIF5A4融合蛋白的表達(dá)量最高，隨著IPTG濃度的增加，PtoeIF5A4融合蛋白表達(dá)有輕微下降，當(dāng)IPTG的濃度超過0.5 mmol/L時，融合蛋白表達(dá)明顯下降。因此，后續(xù)的純化試驗(yàn)選擇0.1 mmol/L 為IPTG誘導(dǎo)的濃度。在28℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，PtoeIF5A4融合蛋白主要以可溶性的形式存在，主要分布在上清，而在沉淀中的分布較低。研究表明，煙草SKP1基因在無誘導(dǎo)劑IPTG時可以表達(dá)目的蛋白，而在0.01-1.0 mmol/L均無目的蛋白的表達(dá)［14]。梅竹等［15]研究發(fā)現(xiàn)，在0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)下，GSTSmad4融合蛋白主要以可溶性的形式存在。這些結(jié)果表明，不同的蛋白所需要的最適IPTG的誘導(dǎo)濃度各有不同，低濃度IPTG誘導(dǎo)有助于融合蛋白形成可溶性蛋白。

4 結(jié)論

利用pET28-PtoeIF5A4重組載體成功表達(dá)了融合有His標(biāo)簽的PtoeIF5A4重組蛋白，并且還對該融合蛋白進(jìn)行了純化及鑒定。利用純化出的蛋白制備抗體進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記明確其在體內(nèi)的亞細(xì)胞定位或通過免疫共沉淀篩選楊樹PtoeIF5A4的互作蛋白。

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