王 婧， 李靜心， 孟春花， 朱前明， 劉 勇， 曹少先， 王慧利

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;3.阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236041)

組蛋白乙?；潜碛^遺傳修飾的重要組成部分，在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能［1-2］。組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；?HDACs)密切相關(guān)，HDACs分為 I、II、III、IV 4 類(lèi)亞型［3］，主要負(fù)責(zé)組蛋白去乙酰化，并在活性受到抑制后乙?；缴摺２溉閯?dòng)物中的研究多集中于廣譜性HDACs抑制劑處理卵母細(xì)胞改變乙?；癄顟B(tài)［4-7］，對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程中具體調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型知之不多。

哺乳動(dòng)物中，生發(fā)泡(Germinal vesicle，GV)期卵母細(xì)胞組蛋白均高度乙?；?，但對(duì)于減數(shù)分裂過(guò)程中是否存在組蛋白乙酰化/去乙?；膭?dòng)態(tài)變化，不同研究間存在矛盾［4-11］。此外，利用HDACs抑制劑處理卵母細(xì)胞來(lái)研究組蛋白乙?；瘜?duì)發(fā)育的影響，不同學(xué)者得到的結(jié)論并不相同［12-17］，分析發(fā)現(xiàn)，上述研究所用HDACs抑制劑均為廣譜性藥物，是否因?yàn)檫@種廣譜性抑制導(dǎo)致了對(duì)發(fā)育影響的不確定性?因此，有必要進(jìn)一步研究HDACs特異性抑制后組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響。

本試驗(yàn)以組蛋白H4K12乙?；癁闃?biāo)記，利用免疫熒光技術(shù)，首先對(duì)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中組蛋白乙?；谋磉_(dá)模式進(jìn)行研究，然后分別利用廣譜及特異性HDACs抑制劑處理減數(shù)分裂中的卵母細(xì)胞，以確定調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙酰化的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，最后就組蛋白乙酰化對(duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響進(jìn)行探討，以期為闡明哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中組蛋白乙?；恼{(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)所需試劑除特殊說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma試劑公司。

1.1 卵母細(xì)胞獲取及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用6～8周齡ICR小鼠均購(gòu)自南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，經(jīng)促性腺激素超排后(10 IU/ml PMSG 48 h)，脫頸椎法殺鼠并摘除卵巢，于實(shí)體鏡下刺破卵泡，收集生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞，M2洗滌后轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)液中依試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液為T(mén)CM-199(Gibco)添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、10 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、0.5 IU/ml促卵泡激素(FSH)、0.5 IU/ml黃體生成素(LH)。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，100%濕度。

1.2 卵母細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

卵母細(xì)胞依試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理完畢后，自培養(yǎng)液中取出并脫去卵丘，4%多聚甲醛室溫固定1 h，0.2%Triton X-100(D-PBS配制)處理10～15 min，封閉液(D-PBS含0.2%BSA+0.01%Tween-20)處理1 h，一抗(封閉液稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗(封閉液稀釋)37℃處理2 h，10μg/ml Hoechst 33342室溫染色5 min以標(biāo)記卵母細(xì)胞染色體DNA，染色完畢后將卵母細(xì)胞壓片經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果并采集圖片。其中組蛋白H4K12乙?；贵w購(gòu)自Upstate公司，一抗為Rabbit polyclonal anti-acetyl-H4-Lys12，二抗為 FITC-conjugated goat-anti-rabbit IgG，紡錘體微管抗體為FITC-conjugated anti-α-tubulin monoclonal antibodies。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；癄顟B(tài) 超排后獲取的GV期卵母細(xì)胞放入成熟培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)0 h、6 h、16 h將卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，分別檢測(cè)GV、MI、MII期卵母細(xì)胞的H4K12乙酰化狀態(tài)。1.3.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型 超排后獲取的GV期卵母細(xì)胞分別放入添加廣譜及亞型特異性HDACs抑制劑的成熟培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)16 h將卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，通過(guò)檢測(cè)抑制劑處理后MII期卵母細(xì)胞H4K12乙酰化的變化，確定減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型。

1.3.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙?；g的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 在確定調(diào)控減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；腍DACs亞型的基礎(chǔ)上，通過(guò)2種方法檢測(cè)減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化/去乙?；淖兓?guī)律:①先正常培養(yǎng)卵母細(xì)胞，然后利用亞型特異性HDACs抑制劑處理;②先利用亞型特異性HDACs抑制劑處理卵母細(xì)胞，然后撤掉抑制劑進(jìn)行正常培養(yǎng)。隨后通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)相應(yīng)處理后卵母細(xì)胞H4K12乙酰化的變化，確定減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙?；膭?dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1.3.4 組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響

超排后獲取的GV期卵母細(xì)胞放入對(duì)照組和試驗(yàn)組培養(yǎng)液中，對(duì)照組不添加HDACs抑制劑，試驗(yàn)組分別添加亞型特異性和廣譜性HDACs抑制劑以增加組蛋白乙?；?。經(jīng)培養(yǎng)16 h后，將卵母細(xì)胞取出，通過(guò)觀察第一極體排出情況，檢測(cè)成熟率的變化;通過(guò)紡錘體微管免疫熒光染色，檢測(cè)紡錘體形態(tài)的變化;通過(guò)Hoechst 33342染色，檢測(cè)染色體排列方式的變化。根據(jù)上述3個(gè)指標(biāo)的變化，探討組蛋白乙酰化對(duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次用卵不少于30枚。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 11.5)的ANOVA模塊分析。數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉(zhuǎn)換(百分?jǐn)?shù)t檢驗(yàn))后，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；癄顟B(tài)

結(jié)果(圖1)顯示，以組蛋白H4K12乙?；癁闃?biāo)記，不同減數(shù)分裂階段的卵母細(xì)胞具有不同的乙?；癄顟B(tài)。GV期卵母細(xì)胞呈現(xiàn)高度的乙?；癄顟B(tài)，而隨減數(shù)分裂啟動(dòng)，GV期染色質(zhì)凝集為致密的染色體，同時(shí)發(fā)生去乙?；?，在MI期和MII期卵母細(xì)胞中均表現(xiàn)為去乙?；癄顟B(tài)。

圖1 GV、MI、MII期卵母細(xì)胞中組蛋白H4K12的乙酰化狀態(tài)Fig.1 Acetylation of histone H4K12 in germinal vesicle，metaphase I，melaphase II oocytes

2.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙酰化的HDACs亞型

以組蛋白H4K12乙?；癁闃?biāo)記，經(jīng)不同類(lèi)型HDACs抑制劑處理后，M II期卵母細(xì)胞呈現(xiàn)不同的乙?；癄顟B(tài)(圖2)。對(duì)照組卵母細(xì)胞未經(jīng)抑制劑處理，呈現(xiàn)去乙?；癄顟B(tài);而利用廣譜性HDACs抑制劑TSA(可同時(shí)抑制I和II型HDACs，100 nmol/L)處理后，卵母細(xì)胞發(fā)生乙?；?，表明I和(或)II型HDACs負(fù)責(zé)卵母細(xì)胞乙酰化;進(jìn)一步利用I型HDACs特異性抑制劑VPA(1 mmol/L)處理后，結(jié)果與對(duì)照組相同，卵母細(xì)胞去乙酰化，表明I型HDACs不參與組蛋白乙酰化;而經(jīng)II型HDACs特異性抑制劑MC1568(20 μmol/L)處理后，與TSA處理相同，卵母細(xì)胞發(fā)生乙?；@表明II型HDACs負(fù)責(zé)減數(shù)分裂過(guò)程中組蛋白乙?；恼{(diào)控。

2.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化/去乙?；膭?dòng)態(tài)變化規(guī)律

通過(guò)2種方法檢測(cè)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化/去乙?；膭?dòng)態(tài)變化規(guī)律。方法一:獲取的新鮮GV期卵母細(xì)胞先正常培養(yǎng)12 h，然后經(jīng)MC1568處理4 h。結(jié)果(圖3)顯示，GV期卵母細(xì)胞中組蛋白高度乙?；囵B(yǎng)12 h后，卵母細(xì)胞發(fā)生去乙酰化，而在培養(yǎng)12 h后再利用MC1568處理4 h，卵母細(xì)胞則重新乙?；７椒ǘ?獲取的新鮮GV期卵母細(xì)胞先經(jīng)MC1568處理12 h，然后撤掉MC1568正常培養(yǎng)4 h。結(jié)果(圖3)顯示，GV期卵母細(xì)胞中組蛋白高度乙酰化，MC1568處理12 h后卵母細(xì)胞仍然保持乙?；?，而在撤掉MC1568后正常培養(yǎng)4 h，卵母細(xì)胞則發(fā)生去乙?；?。上述2種方法得到的結(jié)果表明，在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，存在組蛋白乙?；?去乙酰化的動(dòng)態(tài)變化。

2.4 組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響

采用3個(gè)指標(biāo)(成熟率、紡錘體形態(tài)和染色體排列方式)反映組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示:培養(yǎng)液中添加20μmol/L MC1568后，卵母細(xì)胞的成熟未受影響，成熟率均超過(guò)90%(圖4);卵母細(xì)胞經(jīng)MC1568處理后，紡錘體形態(tài)并未發(fā)生明顯改變，均表現(xiàn)為典型的紡錘體形態(tài)(圖5);卵母細(xì)胞經(jīng)MC1568處理后，染色體的排列方式未受影響，呈典型的中期排列形態(tài)(圖6)。說(shuō)明II型HDACs特異性抑制劑MC1568處理并未對(duì)卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量產(chǎn)生影響。

圖2 不同種類(lèi)HDACs抑制劑處理后M II期卵母細(xì)胞中組蛋白H4K12的乙酰化狀態(tài)Fig.2 Acetylation of histone H4K12 in melaphase II oocytes treated with different HDACs inhibitors

圖3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙?；膭?dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in histone acetylation/deacetylation during meiosis

圖4 組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響Fig.4 Effects of histone acetylation on rates of oocyte maturation

進(jìn)一步利用廣譜性HDACs抑制劑TSA替代MC1568處理卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)100 nmol/L TSA處理后，卵母細(xì)胞的成熟能力和紡錘體結(jié)構(gòu)均未受顯著影響，但與對(duì)照組及MC1568處理組相比，約有30%的卵母細(xì)胞染色體排列方式發(fā)生了改變，結(jié)構(gòu)比較松散，分布面積變大(圖6)。說(shuō)明廣譜性HDACs抑制劑處理影響了卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。

圖5 組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)的影響Fig.5 Effects of histone acetylation on spindle morphology of oocytes

圖6 組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞染色體排列的影響Fig.6 Effects of histone acetylation on chromosome alignment of oocytes

3 討論

組蛋白乙酰化有利于核小體DNA與組蛋白八聚體的解離，使染色體結(jié)構(gòu)松弛，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙酰化則可導(dǎo)致組蛋白與DNA緊密結(jié)合，染色體致密卷曲，抑制基因轉(zhuǎn)錄。本研究中，減數(shù)分裂啟動(dòng)后，小鼠卵母細(xì)胞由GV期的乙?；D(zhuǎn)變?yōu)镸 I和M II期的去乙?；?，并且這種轉(zhuǎn)變伴隨著相對(duì)松散的染色質(zhì)凝集為致密的染色體，以及基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的中止［18］，這正體現(xiàn)了組蛋白乙?；?去乙?；瘜?duì)染色質(zhì)(體)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的調(diào)控。

研究者多利用廣譜HDACs抑制劑處理哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞，通過(guò)抑制整個(gè)HDACs酶家族的活性，使組蛋白乙酰化水平升高［6-7，11］，但對(duì)于酶家族內(nèi)具體發(fā)揮作用的HDACs亞型及分子知之不多，目前僅見(jiàn)Endo等初步鑒定了豬卵母細(xì)胞中調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)I型HDACs并非組蛋白去乙?；匦瑁?9］。本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中I型HDACs不參與組蛋白的去乙?；?，并且進(jìn)一步證明II型HDACs發(fā)揮了去乙?；δ?。

組蛋白乙?；?去乙酰化，分別由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和HDACs所催化。HATs和 HDACs存在動(dòng)態(tài)的平衡，當(dāng)HDACs受到抑制，HATs活化，組蛋白乙?；?當(dāng)HATs受到抑制，HDACs活化，組蛋白去乙?；?。本研究通過(guò)2種方法從不同側(cè)面確認(rèn)了小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中存在組蛋白乙?；?去乙酰化間的動(dòng)態(tài)變化，表明卵母細(xì)胞中的HATs和HDACs均具有活性，協(xié)同調(diào)控組蛋白乙?；?去乙?；淖兓?。但Kim等發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細(xì)胞正常培養(yǎng)14 h后用TSA處理3 h，組蛋白未重新乙酰化，表明HATs沒(méi)有活性［7］。我們推測(cè)，原因可能在于TSA處理時(shí)間較短，HDACs受到抑制后HATs活化需要時(shí)間。在進(jìn)一步重復(fù)Kim等的試驗(yàn)后，我們發(fā)現(xiàn)TSA處理3 h后，組蛋白乙酰化的確不明顯，但延長(zhǎng)至4 h，組蛋白重新乙?；?，與本研究結(jié)果一致。

利用II型HDACs抑制劑MC1568處理增加乙?；胶?，小鼠卵母細(xì)胞的成熟率、紡錘體結(jié)構(gòu)及染色體排列方式均未受影響，但經(jīng)廣譜抑制劑TSA處理后，染色體的結(jié)構(gòu)變得松散，并且分布面積變大。這在一定程度上驗(yàn)證了前言中的推測(cè)，即廣譜HDACs抑制劑導(dǎo)致整個(gè)HDACs酶家族活性受到抑制，包括與組蛋白乙?；療o(wú)關(guān)的HDACs酶活性也受到抑制，這可能導(dǎo)致對(duì)卵母細(xì)胞有益和有害的HDACs分子間存在不同程度的相互抵消，因此產(chǎn)生了對(duì)成熟和發(fā)育影響的不確定性，導(dǎo)致不同研究者間結(jié)論的差異。在進(jìn)一步明確卵母細(xì)胞中發(fā)揮作用的HDACs亞型后，就本試驗(yàn)的成熟質(zhì)量指標(biāo)而言，特異性升高組蛋白乙?；瘜?duì)發(fā)育并無(wú)損害。

綜上所述，本研究確定了小鼠卵母細(xì)胞中調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型，揭示了減數(shù)分裂期間存在組蛋白乙酰化/去乙酰化的動(dòng)態(tài)變化，并明確了組蛋白乙?；瘜?duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響，這為提高哺乳動(dòng)物胚胎體外生產(chǎn)效率及闡明組蛋白乙酰化調(diào)控的分子機(jī)制提供了參考。

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