王 婧， 李靜心， 孟春花， 朱前明， 劉 勇， 曹少先， 王慧利

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;3.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236041)

組蛋白乙?；潜碛^遺傳修飾的重要組成部分，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能［1-2］。組蛋白乙酰化與組蛋白去乙?；?HDACs)密切相關(guān)，HDACs分為 I、II、III、IV 4 類亞型［3］，主要負責(zé)組蛋白去乙?；⒃诨钚允艿揭种坪笠阴；缴摺２溉閯游镏械难芯慷嗉杏趶V譜性HDACs抑制劑處理卵母細胞改變乙?；癄顟B(tài)［4-7］，對減數(shù)分裂過程中具體調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型知之不多。

哺乳動物中，生發(fā)泡(Germinal vesicle，GV)期卵母細胞組蛋白均高度乙?；?，但對于減數(shù)分裂過程中是否存在組蛋白乙酰化/去乙?；膭討B(tài)變化，不同研究間存在矛盾［4-11］。此外，利用HDACs抑制劑處理卵母細胞來研究組蛋白乙?；瘜Πl(fā)育的影響，不同學(xué)者得到的結(jié)論并不相同［12-17］，分析發(fā)現(xiàn)，上述研究所用HDACs抑制劑均為廣譜性藥物，是否因為這種廣譜性抑制導(dǎo)致了對發(fā)育影響的不確定性?因此，有必要進一步研究HDACs特異性抑制后組蛋白乙酰化對卵母細胞發(fā)育的影響。

本試驗以組蛋白H4K12乙?；癁闃擞洠妹庖邿晒饧夹g(shù)，首先對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中組蛋白乙酰化的表達模式進行研究，然后分別利用廣譜及特異性HDACs抑制劑處理減數(shù)分裂中的卵母細胞，以確定調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型。在此基礎(chǔ)上，進一步明確減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙酰化的動態(tài)變化規(guī)律，最后就組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒熨|(zhì)量的影響進行探討，以期為闡明哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂過程中組蛋白乙?；恼{(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗所需試劑除特殊說明外均購自Sigma試劑公司。

1.1 卵母細胞獲取及培養(yǎng)

試驗所用6～8周齡ICR小鼠均購自南京市青龍山動物繁殖場，經(jīng)促性腺激素超排后(10 IU/ml PMSG 48 h)，脫頸椎法殺鼠并摘除卵巢，于實體鏡下刺破卵泡，收集生發(fā)泡(GV)期卵母細胞，M2洗滌后轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)液中依試驗設(shè)計進行培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液為TCM-199(Gibco)添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、10 ng/ml表皮生長因子(EGF)、0.5 IU/ml促卵泡激素(FSH)、0.5 IU/ml黃體生成素(LH)。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，100%濕度。

1.2 卵母細胞免疫熒光檢測

卵母細胞依試驗設(shè)計處理完畢后，自培養(yǎng)液中取出并脫去卵丘，4%多聚甲醛室溫固定1 h，0.2%Triton X-100(D-PBS配制)處理10～15 min，封閉液(D-PBS含0.2%BSA+0.01%Tween-20)處理1 h，一抗(封閉液稀釋)4℃孵育過夜，二抗(封閉液稀釋)37℃處理2 h，10μg/ml Hoechst 33342室溫染色5 min以標記卵母細胞染色體DNA，染色完畢后將卵母細胞壓片經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果并采集圖片。其中組蛋白H4K12乙?；贵w購自Upstate公司，一抗為Rabbit polyclonal anti-acetyl-H4-Lys12，二抗為 FITC-conjugated goat-anti-rabbit IgG，紡錘體微管抗體為FITC-conjugated anti-α-tubulin monoclonal antibodies。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；癄顟B(tài) 超排后獲取的GV期卵母細胞放入成熟培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)0 h、6 h、16 h將卵母細胞進行免疫熒光染色，分別檢測GV、MI、MII期卵母細胞的H4K12乙酰化狀態(tài)。1.3.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型 超排后獲取的GV期卵母細胞分別放入添加廣譜及亞型特異性HDACs抑制劑的成熟培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)16 h將卵母細胞進行免疫熒光染色，通過檢測抑制劑處理后MII期卵母細胞H4K12乙?；淖兓?，確定減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙酰化的HDACs亞型。

1.3.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化/去乙酰化間的動態(tài)變化規(guī)律 在確定調(diào)控減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；腍DACs亞型的基礎(chǔ)上，通過2種方法檢測減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙酰化的變化規(guī)律:①先正常培養(yǎng)卵母細胞，然后利用亞型特異性HDACs抑制劑處理;②先利用亞型特異性HDACs抑制劑處理卵母細胞，然后撤掉抑制劑進行正常培養(yǎng)。隨后通過免疫熒光染色檢測相應(yīng)處理后卵母細胞H4K12乙?；淖兓_定減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙酰化的動態(tài)變化規(guī)律。

1.3.4 組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒熨|(zhì)量的影響

超排后獲取的GV期卵母細胞放入對照組和試驗組培養(yǎng)液中，對照組不添加HDACs抑制劑，試驗組分別添加亞型特異性和廣譜性HDACs抑制劑以增加組蛋白乙酰化水平。經(jīng)培養(yǎng)16 h后，將卵母細胞取出，通過觀察第一極體排出情況，檢測成熟率的變化;通過紡錘體微管免疫熒光染色，檢測紡錘體形態(tài)的變化;通過Hoechst 33342染色，檢測染色體排列方式的變化。根據(jù)上述3個指標的變化，探討組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒熨|(zhì)量的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組試驗至少重復(fù)3次，每次用卵不少于30枚。試驗數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS 11.5)的ANOVA模塊分析。數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉(zhuǎn)換(百分數(shù)t檢驗)后，進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；癄顟B(tài)

結(jié)果(圖1)顯示，以組蛋白H4K12乙?；癁闃擞?，不同減數(shù)分裂階段的卵母細胞具有不同的乙?；癄顟B(tài)。GV期卵母細胞呈現(xiàn)高度的乙?；癄顟B(tài)，而隨減數(shù)分裂啟動，GV期染色質(zhì)凝集為致密的染色體，同時發(fā)生去乙?；?，在MI期和MII期卵母細胞中均表現(xiàn)為去乙?；癄顟B(tài)。

圖1 GV、MI、MII期卵母細胞中組蛋白H4K12的乙?；癄顟B(tài)Fig.1 Acetylation of histone H4K12 in germinal vesicle，metaphase I，melaphase II oocytes

2.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型

以組蛋白H4K12乙酰化為標記，經(jīng)不同類型HDACs抑制劑處理后，M II期卵母細胞呈現(xiàn)不同的乙?；癄顟B(tài)(圖2)。對照組卵母細胞未經(jīng)抑制劑處理，呈現(xiàn)去乙?；癄顟B(tài);而利用廣譜性HDACs抑制劑TSA(可同時抑制I和II型HDACs，100 nmol/L)處理后，卵母細胞發(fā)生乙酰化，表明I和(或)II型HDACs負責(zé)卵母細胞乙?；?進一步利用I型HDACs特異性抑制劑VPA(1 mmol/L)處理后，結(jié)果與對照組相同，卵母細胞去乙?；砻鱅型HDACs不參與組蛋白乙?；?而經(jīng)II型HDACs特異性抑制劑MC1568(20 μmol/L)處理后，與TSA處理相同，卵母細胞發(fā)生乙?；@表明II型HDACs負責(zé)減數(shù)分裂過程中組蛋白乙?；恼{(diào)控。

2.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙酰化的動態(tài)變化規(guī)律

通過2種方法檢測卵母細胞減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙?；膭討B(tài)變化規(guī)律。方法一:獲取的新鮮GV期卵母細胞先正常培養(yǎng)12 h，然后經(jīng)MC1568處理4 h。結(jié)果(圖3)顯示，GV期卵母細胞中組蛋白高度乙?；?，培養(yǎng)12 h后，卵母細胞發(fā)生去乙?；?，而在培養(yǎng)12 h后再利用MC1568處理4 h，卵母細胞則重新乙?；７椒ǘ?獲取的新鮮GV期卵母細胞先經(jīng)MC1568處理12 h，然后撤掉MC1568正常培養(yǎng)4 h。結(jié)果(圖3)顯示，GV期卵母細胞中組蛋白高度乙?；琈C1568處理12 h后卵母細胞仍然保持乙?；?，而在撤掉MC1568后正常培養(yǎng)4 h，卵母細胞則發(fā)生去乙?；?。上述2種方法得到的結(jié)果表明，在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中，存在組蛋白乙酰化/去乙?；膭討B(tài)變化。

2.4 組蛋白乙酰化對卵母細胞成熟質(zhì)量的影響

采用3個指標(成熟率、紡錘體形態(tài)和染色體排列方式)反映組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒熨|(zhì)量的影響。結(jié)果顯示:培養(yǎng)液中添加20μmol/L MC1568后，卵母細胞的成熟未受影響，成熟率均超過90%(圖4);卵母細胞經(jīng)MC1568處理后，紡錘體形態(tài)并未發(fā)生明顯改變，均表現(xiàn)為典型的紡錘體形態(tài)(圖5);卵母細胞經(jīng)MC1568處理后，染色體的排列方式未受影響，呈典型的中期排列形態(tài)(圖6)。說明II型HDACs特異性抑制劑MC1568處理并未對卵母細胞的成熟質(zhì)量產(chǎn)生影響。

圖2 不同種類HDACs抑制劑處理后M II期卵母細胞中組蛋白H4K12的乙?；癄顟B(tài)Fig.2 Acetylation of histone H4K12 in melaphase II oocytes treated with different HDACs inhibitors

圖3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?；?去乙?；膭討B(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in histone acetylation/deacetylation during meiosis

圖4 組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒炻实挠绊慒ig.4 Effects of histone acetylation on rates of oocyte maturation

進一步利用廣譜性HDACs抑制劑TSA替代MC1568處理卵母細胞，發(fā)現(xiàn)100 nmol/L TSA處理后，卵母細胞的成熟能力和紡錘體結(jié)構(gòu)均未受顯著影響，但與對照組及MC1568處理組相比，約有30%的卵母細胞染色體排列方式發(fā)生了改變，結(jié)構(gòu)比較松散，分布面積變大(圖6)。說明廣譜性HDACs抑制劑處理影響了卵母細胞的成熟質(zhì)量。

圖5 組蛋白乙?；瘜β涯讣毎忓N體形態(tài)的影響Fig.5 Effects of histone acetylation on spindle morphology of oocytes

圖6 組蛋白乙?；瘜β涯讣毎旧w排列的影響Fig.6 Effects of histone acetylation on chromosome alignment of oocytes

3 討論

組蛋白乙?；欣诤诵◇wDNA與組蛋白八聚體的解離，使染色體結(jié)構(gòu)松弛，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙?；瘎t可導(dǎo)致組蛋白與DNA緊密結(jié)合，染色體致密卷曲，抑制基因轉(zhuǎn)錄。本研究中，減數(shù)分裂啟動后，小鼠卵母細胞由GV期的乙?；D(zhuǎn)變?yōu)镸 I和M II期的去乙?；?，并且這種轉(zhuǎn)變伴隨著相對松散的染色質(zhì)凝集為致密的染色體，以及基因轉(zhuǎn)錄活動的中止［18］，這正體現(xiàn)了組蛋白乙酰化/去乙?；瘜θ旧|(zhì)(體)結(jié)構(gòu)及基因表達的調(diào)控。

研究者多利用廣譜HDACs抑制劑處理哺乳動物卵母細胞，通過抑制整個HDACs酶家族的活性，使組蛋白乙酰化水平升高［6-7，11］，但對于酶家族內(nèi)具體發(fā)揮作用的HDACs亞型及分子知之不多，目前僅見Endo等初步鑒定了豬卵母細胞中調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs類型，發(fā)現(xiàn)I型HDACs并非組蛋白去乙?；匦瑁?9］。本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中I型HDACs不參與組蛋白的去乙?；?，并且進一步證明II型HDACs發(fā)揮了去乙?；δ?。

組蛋白乙酰化/去乙?；?，分別由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和HDACs所催化。HATs和 HDACs存在動態(tài)的平衡，當(dāng)HDACs受到抑制，HATs活化，組蛋白乙酰化;當(dāng)HATs受到抑制，HDACs活化，組蛋白去乙?；?。本研究通過2種方法從不同側(cè)面確認了小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中存在組蛋白乙?；?去乙酰化間的動態(tài)變化，表明卵母細胞中的HATs和HDACs均具有活性，協(xié)同調(diào)控組蛋白乙?；?去乙?；淖兓５獽im等發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細胞正常培養(yǎng)14 h后用TSA處理3 h，組蛋白未重新乙酰化，表明HATs沒有活性［7］。我們推測，原因可能在于TSA處理時間較短，HDACs受到抑制后HATs活化需要時間。在進一步重復(fù)Kim等的試驗后，我們發(fā)現(xiàn)TSA處理3 h后，組蛋白乙?；拇_不明顯，但延長至4 h，組蛋白重新乙?；?，與本研究結(jié)果一致。

利用II型HDACs抑制劑MC1568處理增加乙?；胶?，小鼠卵母細胞的成熟率、紡錘體結(jié)構(gòu)及染色體排列方式均未受影響，但經(jīng)廣譜抑制劑TSA處理后，染色體的結(jié)構(gòu)變得松散，并且分布面積變大。這在一定程度上驗證了前言中的推測，即廣譜HDACs抑制劑導(dǎo)致整個HDACs酶家族活性受到抑制，包括與組蛋白乙?；療o關(guān)的HDACs酶活性也受到抑制，這可能導(dǎo)致對卵母細胞有益和有害的HDACs分子間存在不同程度的相互抵消，因此產(chǎn)生了對成熟和發(fā)育影響的不確定性，導(dǎo)致不同研究者間結(jié)論的差異。在進一步明確卵母細胞中發(fā)揮作用的HDACs亞型后，就本試驗的成熟質(zhì)量指標而言，特異性升高組蛋白乙?；瘜Πl(fā)育并無損害。

綜上所述，本研究確定了小鼠卵母細胞中調(diào)控組蛋白乙?；腍DACs亞型，揭示了減數(shù)分裂期間存在組蛋白乙?；?去乙?；膭討B(tài)變化，并明確了組蛋白乙?；瘜β涯讣毎墒熨|(zhì)量的影響，這為提高哺乳動物胚胎體外生產(chǎn)效率及闡明組蛋白乙?；{(diào)控的分子機制提供了參考。

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