亓培培

（淮北市環(huán)保局 環(huán)境檢測(cè)站，安徽 淮北 235000）

肝素（Hep）為葡糖胺聚糖，是蛋白多糖的一種.在人體內(nèi)由肥大細(xì)胞分泌而自然存在于血液中，在體內(nèi)外均有延緩或阻止血液凝固的作用［1］.作為經(jīng)典的抗凝血藥物，肝素在臨床上的應(yīng)用已達(dá)60年之久，目前仍是心血管和血栓病人的首選抗凝血藥［2］.

肝素是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸組成的，具有不同鏈長(zhǎng)的多糖鏈混合物.在水溶液中由于其酸性基團(tuán)的離解而成為帶多個(gè)負(fù)電荷的大陰離子.肝素的檢測(cè)方法有多種，總的分屬于生物方法［3］和化學(xué)方法兩大類.生物方法是法定方法，因受生物個(gè)體的影響較大，不易掌握.化學(xué)方法有分光光度法［4-8］、HPLC法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］、電化學(xué)傳感器［11］等.其中分光光度法因具有操作簡(jiǎn)便、快速、儀器價(jià)廉、靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用.因此進(jìn)一步研究靈敏度高、選擇性好的新分光光度法有重要的意義.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH為1.4～5.8的緩沖溶液中肝素鈉能與亞甲基藍(lán)發(fā)生締合，使溶液出現(xiàn)明顯的褪色，溶液吸光度的減少與肝素鈉濃度成正比，建立了測(cè)定肝素鈉濃度的分光光度法.該方法穩(wěn)定性好，而且反應(yīng)的pH值范圍寬.用于注射用肝素鈉濃度的測(cè)定結(jié)果滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

TU－1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；pHs-3型酸度計(jì)（上海第二分析儀器廠）.

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1.000 g肝素鈉固體（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司），用去離子水溶解稀釋，定容于1 000 mL容量瓶中，其質(zhì)量濃度為1.00 mg/ mL，備用.再準(zhǔn)確量取5.00 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水稀釋，定容于1 000 mL 容量瓶中，制得5.00 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.亞甲基藍(lán)溶液：濃度為5.0×10-4mol/L作為儲(chǔ)備液，再稀釋成2.0×10-5mol/L使用.

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取2.736 g乙酸鈉，量取3 mL 36.5%的乙酸溶液用去離子水稀釋定容于100 mL容量瓶中，備用.根據(jù)體積比配成pH 4.6的緩沖溶液或用酸度計(jì)調(diào)制成pH 4.6的緩沖溶液.

上述所需試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，配制溶液用去離子水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在25 mL的比色管中依次加入pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液2.0 mL，亞甲基藍(lán)溶液1.0 mL和肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 mL，稀釋至刻度，搖勻，放置10 min 后，以水為參比，測(cè)定664 nm 處樣品溶液吸光度A；同時(shí)做試劑空白，吸光度值為A0，并計(jì)算吸光度差值ΔA=A0-A.

2 結(jié)果和討論

2.1 吸收光譜

分別對(duì)未加肝素鈉的1.0 mL 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液和加入20 μg、40 μg、60 μg、80 μg 肝素鈉的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～800 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描所得的吸收光譜如圖1所示.亞甲基藍(lán)溶液在664 nm處的吸收峰出現(xiàn)最大值，加入肝素鈉后，肝素鈉與亞甲基藍(lán)作用使溶液褪色，不加肝素鈉和加入肝素鈉所測(cè)得的吸光度之差ΔA在一定范圍內(nèi)與肝素鈉含量呈線性關(guān)系.

圖1 吸收光譜（1-5肝鈉素濃度）

2.2 緩沖溶液pH對(duì)體系的影響

按實(shí)驗(yàn)方法改變緩沖溶液的pH 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知，在緩沖溶液的pH維持在4.6時(shí)肝素鈉和亞甲基藍(lán)的吸收強(qiáng)度下降顯著，所以本實(shí)驗(yàn)選用pH為4.6的緩沖溶液.

表1 緩沖溶液pH對(duì)體系的影響

2.3 緩沖溶液用量對(duì)體系的影響

按實(shí)驗(yàn)方法改變緩沖溶液的用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，在緩沖溶液用量為2.0 mL時(shí)肝素鈉和亞甲基藍(lán)的吸收強(qiáng)度下降顯著，所以本實(shí)驗(yàn)選用pH值為4.6的緩沖溶液最佳用量為2.0 mL.

圖2 緩沖溶液的用量/（V/mL）

圖3 亞甲基藍(lán)的用量/（V/mL）

2.4 亞甲基蘭用量對(duì)體系的影響

按實(shí)驗(yàn)方法改變亞甲基藍(lán)的用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3.由圖3可知，在2×10-5mol/L亞甲基藍(lán)用量為0.80 mL時(shí)的吸收強(qiáng)度下降最大，因此亞甲基藍(lán)最佳用量可以選擇為0.80 mL.

2.5 試劑加入順序的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，考察了3 種試劑加入順序?qū)w系的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試劑加入順序?qū)w系沒(méi)有影響.

2.6 反應(yīng)時(shí)間的影響

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)時(shí)間的影響結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，亞甲基藍(lán)與肝素鈉反應(yīng)瞬間完成，且吸收強(qiáng)度在1 h內(nèi)保持穩(wěn)定；而空白溶液吸收強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定不變，5 min以后吸收強(qiáng)度逐漸減小，但減小程度變化緩慢，對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響不大，選擇放置5 min.

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

對(duì)多種可能共存物的干擾進(jìn)行了實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)DNA的濃度大于11 μg/ mL時(shí)對(duì)肝素鈉的測(cè)定產(chǎn)生干擾.RNA對(duì)肝素鈉產(chǎn)生干擾的最大濃度為5 μg/ mL.

2.8 工作曲線

按照實(shí)驗(yàn)步驟在最佳條件下測(cè)吸光度繪制工作曲線（見(jiàn)圖5），由圖5可知，0～1.6 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系.線性方程：ΔA=0.191 2c-0.002 9，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4.檢出限是 10 μg/25 mL，對(duì)于0.8 mg/L的肝素鈉5次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，說(shuō)明本法準(zhǔn)確可行.盡管本法靈敏度不是太高，但有使用儀器較簡(jiǎn)單、藥品易得且廉價(jià)，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快速、選擇性較好等優(yōu)點(diǎn).

圖4 時(shí)間掃描圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9 合成樣品的分析

配制了3個(gè)合成試樣進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 合成樣品的分析

［1］周自永.新編常用藥手冊(cè)［M］.北京：金盾出版社，1987.

［2］姬勝利，張?zhí)烀?肝素與低分子肝素的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，1996，17（5）：216-218.

［3］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（第二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：307.

［4］BAND P，LUKTON A.The specific assey of heparin by its chemical properties［J］.Anal Biochem，1982，120（1）：19-21.

［5］王云志，黃喜茹，侯海妮，等.用次甲基藍(lán)測(cè)定肝素鈉注射液的效價(jià)［J］.河北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，13（2）：65-67.

［6］JIAO Q C，LIU Q，SUN C，et al.Investigation on the binging site in heparin by spectrophometry［J］.Talanta，1999，48：1095-1101.

［7］JIAO Q C，LIU Q.Mechanism of interference and a zura response in the heparinassay［J］.Analytical Letters，1998，31（8）：1311-1323.

［8］NMCOVA I，RYCHLOVSKY P，HAVELCOVA M，et al.Determination of heparin using flow injection analysis with spectro?phometric detection［J］.Anal Chm Acta，1999，401：223-228.

［9］毛平，黃曉蘭，李翠貞，等.高效液相色譜法測(cè)定血漿肝素含量［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1995，18（6）：358-360.

［10］AMDOFO S A，WANG H M，LINHARDT R J.Disaccharide compositional analysis of heparin sulfate using capillary zone electrophoresis［J］.Anal Biochem，1991，199（2）：249-255.

［11］MA S H，YANG V C，MEYERHOFF M E.Heparin responsive electrochemical sensor：A preliminary study［J］.Anal Chem，1992，64（6）：694-697.