張新宇,陳馳杰,張文,田洋,陳嚴(yán),王吾謙,鄧子牛,2,李大志,2*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.國家柑橘改良中心長沙分中心,湖南 長沙 410128;3.湖南省園藝研究所,湖南 長沙 410125)
冰糖橙×枸櫞雜交后代的胚搶救及雜種鑒定
張新宇1,陳馳杰1,張文3,田洋1,陳嚴(yán)1,王吾謙1,鄧子牛1,2,李大志1,2*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.國家柑橘改良中心長沙分中心,湖南 長沙 410128;3.湖南省園藝研究所,湖南 長沙 410125)
為獲得冰糖橙×枸櫞的合子苗,以抗柑橘潰瘍病枸櫞為父本,以高感病品種冰糖橙為母本進行雜交,利用胚搶救技術(shù)獲得雜交后代,然后利用篩選出的SSR引物對親本和子代的基因組DNA進行PCR擴增,分析并鑒定雜交后代中的合子苗。結(jié)果表明:在最終獲得的359株雜交后代中,利用SSR標(biāo)記能鑒定出合子苗12株。
冰糖橙;枸櫞;雜種鑒定;胚搶救技術(shù)
冰糖橙(Citrus sinensis Osbeck ‘Cheng’)為湖南省主栽的甜橙品種之一,是高度感柑橘潰瘍病的品種[1–2]。柑橘潰瘍病嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中運用農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等技術(shù)來防治柑橘潰瘍病,但均不能徹底根治[4–7]。Deng等[8]對湖南柑橘資源接種離體和活體潰瘍病菌,獲得了1個主動抗?jié)儾≠Y源——枸櫞。近年來,胚搶救技術(shù)在柑橘育種中的應(yīng)用越來越廣泛。該技術(shù)有效地克服了柑橘的多胚性障礙[9],加快了育種進程。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)已被廣泛用于對柑橘合子苗的早期鑒定[10–11]。本試驗中將冰糖橙與枸櫞進行雜交,通過胚搶救技術(shù)獲得雜交后代,再利用SSR分子標(biāo)記對雜交后代進行早期鑒定,旨在為柑橘雜交育種提供參考。
1.1 材 料
母本冰糖橙來自湖南省懷化洪江市安江鎮(zhèn),父本枸櫞(Cirtrus medica L.)來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘改良中心長沙分中心。
在枸櫞開花前采集花粉,干燥保存。在冰糖橙花藥成熟,但花朵未開放時,對母本去雄,并授以父本枸櫞的花粉,然后套袋防止污染。
1.2 方 法
1.2.1 利用胚搶救技術(shù)獲得雜交后代
授粉后約 90 d采收果實。在超凈工作臺上用75%的乙醇將果實表面消毒,然后在酒精燈上灼燒,直至果實顏色變黑。用手術(shù)刀沿果實赤道面劃開一道口子(勿碰傷種子)。取出種子,剝開種皮,將胚分離,置于MT+1 mg/L GA3+10%蔗糖的固體培養(yǎng)基中。待胚成熟后,將胚移入MT+1 mg/L GA3+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中。
1.2.2 雜交后代的移栽
將發(fā)酵好的營養(yǎng)土進行高溫、高壓滅菌。在超凈工作臺上移栽培養(yǎng)皿中的幼苗。用無菌水洗凈幼苗根部殘留的培養(yǎng)基,將幼苗栽入裝有營養(yǎng)土的小塑料盆中。將移栽后的幼苗置于26℃、相對濕度80%的組培室生長,待幼苗長出新的葉片后進行煉苗。煉苗成功后,將幼苗移栽到大塑料盆中,置于塑料大棚中生長。
1.2.3 親本和子代基因組DNA的提取及濃度檢測
參照改良的CTAB法,提取親本葉片和子代幼苗葉片的基因組DNA,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測親本和子代的基因組DNA濃度和純度。
1.2.4 親本和子代基因組DNA的PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測
PCR反應(yīng)體系20 μL,其中10×PCR Buffer 2 μL,MgCl2(20 mmol/L)2 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL,上游引物(2.5 μmol/L)2 μL,下游引物(2.5 μmol/L)2 μL,Taq聚合酶(2 U/μL)0.5 μL,DNA模板1.5 μL,無菌ddH2O 9.7 μL。
PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,Tm復(fù)性1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存。
采用3.0%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳,電壓120 V,時間30 min,利用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照和觀測。
1.2.5 SSR標(biāo)記引物的篩選
從32對引物(表1)中篩選出能在親本間產(chǎn)生特異性位點的引物,然后利用得到的特異性引物對雜交后代的基因組DNA進行擴增分析。
表1 32對引物組合Table 1 32 primer combinations
1.2.6 雜交后代的鑒定
參照文獻[12],用篩選出的多態(tài)性高、能在親本間產(chǎn)生特異性位點的引物對雜交后代進行鑒定:雜交后代SSR帶譜中的條帶均來自父本和母本,沒有雜帶出現(xiàn),并具有父本的特異性條帶時,判斷這個雜交后代為真雜種。
2.1 冰糖橙與枸櫞的雜交授粉和胚搶救結(jié)果
以枸櫞為父本,對母本冰糖橙授粉5 000朵花,結(jié)果502個,座果率為10.04%,明顯高于理論座果率,其原因可能是授粉提高了座果率,或是父、母本之間的親和性較好。剝離其中的121個果實,得到330粒種子,獲得2 217個胚,單種子平均胚數(shù)為 6.72個,可見,冰糖橙×枸櫞的種子具有多胚性。2 217個胚經(jīng)過胚搶救(圖1),獲得547株幼苗,成苗率為24.67%。煉苗和移苗(圖1)后經(jīng)過4個月的生長,最終得到雜交后代 359株,成活率為65.63%。胚的死亡原因可能是操作失誤,或是培養(yǎng)過程中長霉導(dǎo)致,也可能是胚較弱小,不易成苗。
圖1 冰糖橙×枸櫞的果實、分離及培養(yǎng)過程中的雜種胚、移栽的幼苗Fig. 1 Fruits, hybrid embryos in the process of isolation and culture and transplanted seedlings of sweet orange and citron
2.2 冰糖橙與枸櫞雜交后代的形態(tài)學(xué)觀察
珠心苗與合子苗的主要差異是新梢顏色。父本枸櫞的新梢顏色為紫紅色,冰糖橙則為嫩綠色,6株雜交后代出現(xiàn)了深淺不同的紫紅色,可初步認(rèn)定這6株雜交后代為合子苗(圖2)。
圖2 父、母本及雜交后代的新梢Fig. 2 New shoots of parents and hybrid offspring
2.3 DNA的提取和特異引物的篩選結(jié)果
提取的各材料基因組DNA條帶大小一致,沒有蛋白質(zhì)和RNA污染(圖3),可用于后續(xù)試驗。利用 32對引物對冰糖橙和枸櫞的基因組 DNA進行PCR擴增,從中篩選出 CAT01、AG14、GA18、CAC33、CTT01、CAGG9和TAA27等共7對重復(fù)性好、多態(tài)性高的引物(圖4)。
圖3 DNA檢測結(jié)果Fig. 3 DNA detection
圖4 親本對SSR引物的篩選結(jié)果Fig. 4 Screened results of parents to SSR primers
2.4 雜交后代的鑒定結(jié)果
在用引物GA–18對枸櫞雜種后代進行鑒定時,子代4、5、6、12、18、19、22出現(xiàn)了父本的特異性條帶(圖5);用引物CAT–01、AG–14進行鑒定時,子代4、5、6、12、18、19、22同樣出現(xiàn)了父本的特異性條帶(圖6、7),由此可確定子代4、5、6、12、18、19、22為合子苗。最終從359株雜交后代中鑒定出合子苗12株。在形態(tài)學(xué)上發(fā)生顏色變化的6株雜交后代,經(jīng)分子標(biāo)記鑒定皆為合子苗。此外,還鑒定出6株未發(fā)生形態(tài)學(xué)變化的雜交后代為合子苗。
圖5 引物GA–18對雜交后代的SSR檢測結(jié)果Fig. 5 Test results of SSR fingerprint amplified with primer GA–18 in hybrids
圖6 引物CAT–01對雜交后代的SSR檢測結(jié)果Fig. 6 Test results of SSR fingerprint amplified with primer CAT–01 in hybrids
圖7 引物AG–14對雜交后代的SSR檢測結(jié)果Fig.7 Test results of SSR fingerprint amplified with primer AG–14 in hybrids
a.有性雜交和胚搶救。湖南的柑橘種質(zhì)資源豐富,地方性良種多,為柑橘的雜交育種提供了便利條件。由于冰糖橙具有多胚性,多數(shù)無性胚在生長過程中競爭有性胚的營養(yǎng),造成有性胚的生長較弱或死亡。本試驗中利用胚搶救技術(shù)獲得了359株雜交后代,可見,胚搶救技術(shù)能提高柑橘育種效率,加快雜交育種進程。
b.冰糖橙×枸櫞雜交后代的 SSR鑒定。目前,SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和雜種鑒定。韓國輝等[13]利用SSR分子標(biāo)記鑒定了柑橘2個不同雜交組合的子代,鑒定率分別達99.04%和100%。劉夢培等[14]利用6對SSR引物對華仁杏的雜交后代進行了鑒定,鑒定率達91.25%,說明利用SSR分子標(biāo)記進行雜種的早期鑒定是切實可行的。本試驗中利用SSR引物GA–18、CAT–01和AG–14對359株雜交后代進行鑒定,最終鑒定出合子苗12株。
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責(zé)任編輯:王賽群
英文編輯:王 庫
Embryo rescue and hybrid identification of sweet orange (Bingtang) and citron
ZHANG Xin-yu1, CHEN Chi-jie1, ZHANG Wen3, TIAN Yang1, CHEN Yan1, WANG Wu-qian1, DENG Zi-niu1,2, LI Da-zhi1,2*
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Changsha Subcenter, National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, China; 3.Hunan Horticultural and Research Institute, Changsha 410125, China)
In order to obtain zygotic seedlings from hybrid of sweet orange (Bingtang) and citron, a experiment was conducted by taken Bingtang as female parent and citron with resistance to canker as male parent. Embryo rescue technology was firstly used to obtain filial generation, and then the genomic DNA of parents and their hybrids were amplified by PCR using screened simple sequence repeats (SSR) primers, and zygotic seedlings of next generation were further identified. The results showed that twelve zygotic seedlings were identified from the 359 obtained seedlings by SSR markers.
Bingtang sweet orange; citron; molecular marker; embryo rescue
S666
A
1007?1032(2014)02?0157?05
10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.010
投稿網(wǎng)址:http://www.hunau.net/qks
2013–08–02
國家自然科學(xué)基金項目(31071773);“十二·五”國家“863”計劃項目(2011AA100205);湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目(SCX1202)
張新宇(1972—),男,湖南長沙人,碩士研究生,主要從事抗病分子研究,1292333949@qq.com;*通信作者,Ldazhi@163.com