安飛飛，李庚虎，陳霆，李開綿*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

低溫脅迫對木薯葉片葉綠素熒光參數(shù)及PSⅡ相關(guān)蛋白表達水平的影響

安飛飛1,2，李庚虎1,2，陳霆1,2，李開綿1,2*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

以木薯栽培種華南8號(cv. SC8)盆栽苗為材料，研究5 ℃低溫脅迫7 d期間葉片葉綠素含量及熒光參數(shù)、光系統(tǒng) (ⅡPSⅡ)相關(guān)蛋白表達水平的動態(tài)變化。結(jié)果表明：隨著脅迫時間的延長，葉綠素a和葉綠素b含量均先下降后緩慢升高，且均在處理2 d后達到最低；低溫脅迫期間，最大光合效率(Fv/Fm)、光化學量子效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(shù)(qP)、非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)及光合電子傳遞速率(ETR)均顯著下降，其中Fv/Fm持續(xù)下降，ΦPSⅡ、qP和ETR在脅迫2 d后達到最低后緩慢上升，NPQ在脅迫5 d后達到最低；葉綠素含量、葉綠素熒光參數(shù)顯著下降表明，脅迫后 PSⅡ反應(yīng)中心捕光能力、開放程度及光化學轉(zhuǎn)化效率顯著下降，從而抑制了葉片的光合速率；PSⅡ中D1、D2、放氧復(fù)合體(OEC)及核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的表達水平均在低溫脅迫2 d后達到最低水平，且D1蛋白下調(diào)顯著；PSⅡ中相關(guān)蛋白表達水平下調(diào)，也在蛋白質(zhì)水平上驗證了低溫脅迫抑制葉片的光合速率。

木薯；低溫脅迫；葉綠素熒光；蛋白質(zhì)

木薯(Manihot esculenta Crantz)為大戟科(Euphorbiaceae)作物，原產(chǎn)于南美熱帶地區(qū)，具有高生物量、高淀粉、抗旱、耐貧瘠等諸多優(yōu)良特性[1]。目前，木薯主要種植于南北緯30°間，海拔2 km以下，年均氣溫≥18 ℃、無霜期在8個月以上的地區(qū)[2]。木薯最適生長溫度為25～29 ℃。當溫度為14 ℃時生長會受到抑制，10 ℃以下時停止生長，并受寒害[3]。木薯受到低溫脅迫后，葉片脯氨酸含量增幅提高，葉綠素含量下降變慢[4]，可溶性淀粉、丙二醛及保護酶活性[5]也受影響。在低溫脅迫后的恢復(fù)過程中，木薯的脯氨酸、葉綠素含量增加較快[4]。木薯耐寒性與細胞膜透性、SOD和POD活性、MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量息息相關(guān)[6]。

到目前為止，木薯應(yīng)對低溫脅迫的耐寒機理尚未清楚，低溫脅迫對木薯葉片光合效率及相關(guān)蛋白質(zhì)表達水平的影響少見報道。本研究以國內(nèi)推廣較多的高產(chǎn)、高淀粉栽培種華南8號(cv. SC8)盆栽苗為材料，進行5 ℃低溫處理，測定低溫處理7 d內(nèi)葉綠素含量及葉綠素熒光參數(shù)的變化，并利用Western Blot技術(shù)檢驗D1、D2、OEC及Rubisco的表達水平，旨在為揭示木薯的耐寒機理和耐寒育種提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

木薯 SC8來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃。選取生長40 d左右、長勢大體一致的盆栽苗置于恒溫恒濕箱內(nèi)，在(25±1) ℃、3 000 lx，16 h/8 h(光/暗)光照周期條件下培養(yǎng) 1 d。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度基本穩(wěn)定后，收集葉片作為未處理樣品，后將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為每分鐘下降0.03 ℃直至5 ℃，其他條件不變。待溫度剛剛降到5 ℃時，收集葉片(設(shè)為0天)，之后每隔1 d收集葉片用于檢測。

1.2 方 法

1.2.1 葉綠素含量的測定

參照文獻[7]提取葉綠素。稱取0.1 g木薯葉片，剪碎，加入10 mL 95%的乙醇，避光浸泡提取至葉片無綠色。吸取葉綠素提取液，以95%的乙醇為對照，分別在波長663 nm和645 nm處測定吸光度。按下面的公式分別計算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量。

式中：V為提取液用量(mL)；W為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定

于2013年5月20日至28日定時(10:00)將木薯植株暗適應(yīng)約20 min，進行周期性飽和脈沖(6 000 μmol·m–2·s–1，脈沖時間0.8 s)后，用便攜式調(diào)制葉綠素熒光儀 PAM–2500(WALZ，German)直接放在植株葉片上測定Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ及ETR。

1.2.3 PSⅡ相關(guān)蛋白表達的分析

參照Carvalho等[8]的方法，取0.5 g木薯葉片，經(jīng)丙酮沉淀后得到蛋白質(zhì)。用Western Blot分析D1、D2、OEC及Rubisco的表達水平。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003和DPS v7.55統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，差異顯著性標準采用新復(fù)極差法(Duncan)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對木薯葉片葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，在低溫處理過程中，隨著時間的延長，SC8葉片葉綠素a和葉綠素b含量均呈先下降、后緩慢升高、最終恢復(fù)低溫處理前的水平的規(guī)律。低溫處理前期，葉綠素a和葉綠素b含量呈下降趨勢，且葉綠素a下降速度較快。由此可見，低溫處理對葉綠素的影響主要表現(xiàn)為對葉綠素a的影響。在低溫處理1 d后，葉綠素a和葉綠素b含量分別為1.80和0.55 mg/g，顯著低于處理前的1.99 和0.61 mg/g，且差異達到極顯著水平(P＜0.01)；低溫處理2 d后，葉綠素a含量和葉綠素b含量均達到最低值，分別為1.66和0.46 mg/g；之后隨著時間的延長，葉綠素a和葉綠素b含量緩慢上升，但在低溫處理5 d后又出現(xiàn)下降；低溫處理7 d后，葉綠素a和葉綠素b含量基本恢復(fù)到處理前的水平，分別為1.97和0.64 mg/g。

2.2 低溫脅迫對木薯葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表1可知，低溫脅迫后不同時間點收集的葉片的Fv/Fm有顯著性差異，且隨著脅迫時間的延長，其值也持續(xù)下降，在處理7 d后達到最低值0.273。表明低溫脅迫顯著降低了木薯葉片 PSⅡ的潛在光合效率。低溫脅迫2 d內(nèi)，ΦPSⅡ顯著下降，在2 d后達到最低值0.004，表明此時PSⅡ反應(yīng)中心的光能捕獲效率最低。低溫脅迫后qP及ETR均表現(xiàn)出和ΦPSⅡ相同的變化規(guī)律，低溫脅迫2 d后，qP為0.023，ETR為7.67，顯著低于處理前的水平，表明此時 PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度最低，光合電子傳遞速率均達到最低。隨著低溫脅迫時間的延長，NPQ顯著下降，在5 d后達到最低值，后緩慢上升，表明低溫脅迫后，木薯耗散過剩光能能力下降，光保護能力降低，脅迫5 d達到最低值后，光保護能力緩慢得到恢復(fù)。

表1 低溫脅迫下木薯葉片的葉綠素熒光動力學參數(shù)Table 1 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of cassava leaves under low temperature

2.3 低溫脅迫對PSⅡ相關(guān)蛋白表達水平的影響

圖2 D1、D2、OEC及Rubisco蛋白的Western Blot分析結(jié)果Fig. 2 Western Blot analysis of proteins D1, D2, OEC and Rubisco

利用Western Blot技術(shù)對低溫脅迫7 d內(nèi)D1、D2、OEC及Rubisco表達水平進行分析，結(jié)果見圖2。低溫脅迫后，D1蛋白的表達水平顯著下調(diào)，且在脅迫2 d后基本不表達，表明此時D1蛋白降解速率遠大于合成速率，后隨著脅迫時間的延長緩慢上調(diào)，此時其合成速率大于降解速率。D2蛋白的表達水平在脅迫后下調(diào)，且脅迫2 d時達到最低，脅迫7 d后恢復(fù)到低溫處理前的水平。OEC在脅迫過程中表達水平下調(diào)較緩，在脅迫2 d時達到最低，此時PSⅡ的放氧能力較低，7 d后恢復(fù)到低溫處理前的水平。Rubisco的表達水平在低溫脅迫前期下調(diào)明顯，脅迫2 d時最低，后緩慢上升，5 d時又下降，之后上升。這些蛋白表達水平的變化與葉綠素熒光參數(shù)ΦPSⅡ的變化相一致，在蛋白質(zhì)水平上驗證了低溫脅迫抑制葉片的光合作用。

3 結(jié)論與討論

葉片中的色素含量是反映植物光合能力的一個重要指標，葉綠素在光能吸收和轉(zhuǎn)換中起著非常重要的作用[9]。低溫常常引起葉綠素含量變化。白青華等[10]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后辣椒幼苗葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均下降。溫度越低，葉綠素a及總?cè)~綠素含量下降幅度越大[11–12]。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理時間的延長，患白化病小麥的葉綠素含量逐漸降低。高麗慧等[14]、Zhou等[15]也有類似的研究結(jié)論。本試驗中，低溫脅迫初期的木薯葉片葉綠素 a、b含量均呈現(xiàn)下降趨勢，后隨著時間延長緩慢上升。低溫引起木薯葉片葉綠素含量下降的原因可能是低溫脅迫導致光系統(tǒng)發(fā)生不可逆的變化，進而影響到葉綠素含量[16]。此外，低溫會導致葉綠素合成障礙[17]，從而使得葉綠素含量急劇下降。

植物葉片中葉綠素熒光與光合作用中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配等反應(yīng)緊密相連，各種因素對光合作用的影響都可通過葉綠素熒光參數(shù)的變化反映出來[18]。許多脅迫因子，如干旱、熱害和冷害等都可以使PSⅡ光能利用效率下降。本研究中，低溫脅迫后Fv/Fm顯著下降，表明PSⅡ已經(jīng)受到低溫脅迫的損害，這與周建[19]、吳雪霞[20]、劉慧英[21]等的研究結(jié)果一致，其值的下降可能是低溫脅迫導致 PSⅡ反應(yīng)中心失活引起。在逆境脅迫下，PSⅡ反應(yīng)中心失活將嚴重影響光化學反應(yīng)[21]。本試驗中，隨著溫度的降低，ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR均顯著下降，表明PSⅡ反應(yīng)中心失活使得天線色素原初捕光能力減弱，吸收光能減少，光合電子傳遞能力減弱，因此，低溫脅迫降低了PSⅡ的光能捕獲能力與光合電子傳輸能力，進而降低了木薯葉片光合效率。低溫導致光合速率下降在馬鈴薯中也有類似的結(jié)果[22]。

D1、D2蛋白是組成PSⅡ的重要組分[23]，溫度會誘導其構(gòu)象發(fā)生變化，從而抑制 PSⅡ的電子傳遞。D1對溫度特別敏感，正常條件下，D1的合成和降解處于動態(tài)平衡，一旦受到脅迫，D1的降解速率會超過合成速率，導致PSⅡ反應(yīng)中心遭受破壞[24]。本試驗中，D1在脅迫后表達水平急劇下降，此時D1蛋白大量降解，這可能與脅迫環(huán)境中產(chǎn)生的大量活性氧有關(guān)[25]。低溫脅迫常常使相對分子質(zhì)量為33 000的外來蛋白從PSⅡ復(fù)合體中釋放或松散地與PSⅡ結(jié)合，使光合放氧過程不穩(wěn)定[26]，進而使OEC的表達水平下調(diào)。本試驗的結(jié)果也表明，在低溫脅迫后OEC的表達水平下調(diào)。Rubisco活性與光合速率有很好的相關(guān)性[27]。本研究中，低溫脅迫降低了木薯葉片Rubisco活性，這可能是導致葉片光合速率下降的主要原因。

[1] 陳冠喜，李開綿，葉劍秋，等．6個木薯品種生長發(fā)育及產(chǎn)量性狀的初步研究[J]．熱帶農(nóng)業(yè)科學，2009，29(6)：26–29．

[2] 張振文，陸小靜，葉劍秋，等．木薯種植對土壤肥力影響的研究進展[J]．廣西農(nóng)業(yè)科學，2008，39(5)：639–643．

[3] 黃潔，閆慶祥，李開綿，等．木薯嫩莖枝快繁種莖技術(shù)[J]．廣西農(nóng)業(yè)科學，2005，36(6)：506–508．

[4] 周玉飛，曾長英，陳新，等．低溫馴化對木薯耐寒性形態(tài)、生理特性的影響[J]．熱帶農(nóng)業(yè)科學，2011，31(6)：31–36．

[5] 秦翠鮮，楊翠芳，郭元元，等．低溫脅迫對木薯腋芽部分生理指標的影響[J]．熱帶作物學報，2011，32(5)：911–914．

[6] Luo X L，Huang Q F．Studies on the cold resistance of cassava[J]．Journal of Agricultural Science，2012，4(6)：104–119．

[7] 孔祥生．植物生理學實驗技術(shù)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008．

[8] Carvalho L J C B，Lippolis J，Chen S，et al. Characterization of carotenoid–protein complexes and gene expression analysis associated with carotenoid sequestration in pigmented cassava (Manihot esculenta Crantz) storage root[J]．The Open Biochemistry Journal，2012，6：116–130．

[9] Diter von Wettstein，Simon Gough，Kannangara G.Chlorophyll biosynthesis[J]．The Plant Cell，1995，7(7)：1039–1057．

[10] 白青華，郭曉冬，王萍，等．低溫對辣椒幼苗葉片氮及葉綠素含量的影響[J]．甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2009，44(6)：49–51．

[11] 王晶，徐志英，盛云燕．低溫對綠蘿幼苗葉片氮素及葉綠素含量的影響[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011 (15)：208–209．

[12] 王寧，吳軍，夏鵬云，等．低溫脅迫對大葉冬青生理特性的影響[J]．河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，45(4)：407–410．

[13] Liu X G，Xu H，Zhang J Y，et al．Effect of low temperature on chlorophyll biosynthesis in albinism line of wheat (Triticum aestivum) FA85[J]．Physiologia Plantarum，2012，145(3)：384–394．

[14] 高麗慧，易津，李菲．三種禾本科牧草低溫脅迫的生理響應(yīng)[J]．中國草地學報，2011，33(3)：107–111．

[15] Zhou C Y，Yang C D，Zhan L．Effect of low temperature stress on physiological and biochemical characteristics of podocarpus nagi[J]．Agriculture Science and Technology, 2012，13(3)：533–536．

[16] Kudoh H，Sonoike K．Irreversible damage to photosystem I by chilling in the light：Cause of the degradation of chlorophyll after returning to normal growth temperature [J]．Planta，2002，215(4)：541–548．

[17] 劉東奇．淺談低溫對綠色植物葉片中葉綠素含量的影響[J]．中學生物學，2011，27(9)：6–7．

[18] Rohá?ek K，Barták M．Technique of the modulated chlorophyll fluorescence：Basic concepts，useful parameters，and some application[J]．Photosynthetica，1999，37(3)：339–363．

[19] 周建，楊立峰，郝峰鴿，等．低溫脅迫對廣玉蘭幼苗光合及葉綠素熒光特性的影響[J]．西北植物學報，2009，29(1)：136–142．

[20] 吳雪霞，陳建林，查丁石．低溫脅迫對茄子幼苗葉片葉綠素熒光特性和能量耗散的影響[J]．植物營養(yǎng)與肥料學報，2009，15(1)：164–169．

[21] 劉慧英，朱祝軍，史慶華．低溫脅迫下嫁接對西瓜光合特性及葉綠素熒光參數(shù)影響的研究[J]．石河子大學學報：自然科學版，2007，25(2)：163–167．

[22] 秦玉芝，陳玨，邢錚，等．低溫逆境對馬鈴薯葉片光合作用的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2013，39(1)：26–30．

[23] Ort D R，Yocum C F. Vol 4 Oxygenic Photosynthesis：The Light Reactions[M]. New York：Springer-Dordrecht，1996：1–9．

[24] Anderson J M，Park Y I，Chow W S．Photoinactivation and photoprotection of photosystem II in nature[J]. Physiologia Plantarum，1997，100(2)：214–223．

[25] Barker M，de Vries R，Nield J，et al．The deg proteases protect Synechocystis sp．PCC 6803 during heat and light stresses but are not essential for removal of damaged D1 protein during the photosystem two repair cycle[J]．The Journal of Biological Chemistry，2006，281(41)：30347–30355．

[26] 李利紅．水楊酸、Ca2+和 NO對高溫強光脅迫下小麥葉綠體D1蛋白和PSⅡ功能的調(diào)節(jié)作用[D]．鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學生命科學院，2010．

[27] Lange O L，Nobel P S，Osmond C B，et al. Encyclopedia of Plant Physiolgy，NS，Vol．12A：Interaction with the Physical Environment[M]．New York：Springer-Verlag，1981：57–107．

責任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Influence of low temperature stress on chlorophyll fluorescence parameters and expression levels of proteins in PS ofⅡ cassava

AN Fei-fei1,2, LI Geng-hu1,2, CHEN Ting1,2, LI Kai-mian1,2*
(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava, Danzhou, Hainan 571737, China)

Potting seedling of cassava cultivar SC8 was used as materials to investigate the changes of leave chlorophyll content, chlorophyll fluorescence parameters and the expressions of proteins in PSⅡof cassava seedlings exposed to low temperature (5 ℃) for 7 days. The results show that during the stress, chlorophyll a and chlorophyll b contents were both decreased first and then slowly increased, reaching the minimum 2 days after stress; maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), photochemical quantum efficiency of photosystemⅡ(ΦPSII), photochemical quenching (qP), non-photochemical quenching (NPQ) and electron transport rate (ETR ) were significantly decreased with Fv/Fmcontinuously declined, while ΦPSII, qPand ETR first decreased to minimum level 2 days after stress, and then slowly rose, and NPQ decreased to minimum level 5 days after stress. The significant decrease of chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters indicate that the light-harvesting ability, openness and photochemical conversion rate in PSII reaction center were decreased significantly, which inhibiting the photosynthetic efficiency of cassava leaves. The expression level of D1, D2, OEC and Rubisco reached the lowest 2 days after stress with D1 decreased significantly. The down-regulation of theexpression of proteins in PSⅡverifies at protein level that low temperature inhibits photosynthesis of leaves.

cassava; low temperature stress; chlorophyll fluorescence; proteins

S533.01

A

1007?1032(2014)02?0148?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.008

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–08–15

國家“973”計劃項目(2010CB126606)；國家自然科學基金國際合作NSFC–CG項目(31361140366)；“十二·五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012AA101204–2)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(PZS–062)

安飛飛(1985—)，女，河北保定人，碩士，主要從事木薯蛋白質(zhì)組學研究，aff85110@163.com；*通信作者，likaimian@sohu.com