張 微 王靈聰 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310006

姜黃素對急性肺栓塞大鼠NF-κB影響的研究

張 微 王靈聰 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310006

目的 研究姜黃素（CUR）對急性肺栓塞（APE）大鼠肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）的影響。方法 48只SD大鼠隨機分成對照組、假手術(shù)組、模型組和CUR治療組，每組12只。使用自體血栓復(fù)制的方法制備APE大鼠動物模型，栓塞后6、24h各組隨機取大鼠6只，水合氯醛麻醉后分別取肺組織行病理檢查：Western blot檢測NF-κB表達(dá)水平，免疫組化染色檢測NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 肺組織病理證實典型APE的血栓和肺泡壞死出血，CUR能減輕肺組織的病理改變。免疫組化染色可見在肺泡細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、支氣管平滑肌以及巨噬細(xì)胞周圍均有不同程度的NF-κB表達(dá)。栓塞后6、24h，CUR治療組NF-κB陽性細(xì)胞計數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01），接近對照組和假手術(shù)組。栓塞后6、24h時，Western blot檢測結(jié)果顯示，CUR治療組NF-κB蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.01），接近對照組及假手術(shù)組。結(jié)論 CUR可通過下調(diào)APE大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)水平改善其肺部損害，這可能是其干預(yù)APE的作用機制之一。

大鼠；肺栓塞；姜黃素；NF-κB

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是由于內(nèi)源性和外源性栓子堵塞肺動脈主干或分支引起肺循環(huán)障礙的臨床和病理生理綜合征，其病死率僅次于心肌梗死和腫瘤[1]。美國1979年—1999年住院患者中，肺栓塞（PE）的發(fā)病率為0.4%。美國每年有30萬人死于APE，居死亡原因的第三位[2-4]。根據(jù)法國一項社區(qū)研究，PE的發(fā)生率為6.0/10 000[5]。大面積、亞大面積的肺栓塞預(yù)后較差，有報道稱診斷后30天、1年和3年的病死率分別為13%、26%和35.3%[6]。在前期的研究中[7]，我們采用姜黃素（curcumine，CUR）治療肺栓塞已取得一定的療效。核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）在各類細(xì)胞中廣泛存在，參與調(diào)控多種生理及病理過程，在未受刺激的情況下，以無活性的形式存在。目前對于APE后NF-κB的變化及CUR的干預(yù)作用的報道極少，本文觀察經(jīng)CUR干預(yù)后，APE大鼠肺組織NF-κB的表達(dá)情況及CUR的療效，并研究其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1動 物 SPF級雄性SD大鼠，購自無錫江南實驗動物場，動物合格證號：SCXK（蘇）2009-0005。

1.2藥物和試劑 CUR由上海麗臣生物科技有限公司提供，規(guī)格20mg/支，批號110823。Western blot：NF-κB-P65抗體（ab7970）購于Abcam公司；β-Actin抗體（sc-47778）購于Santa Cruz公司；羊抗兔IgGHRP二抗（BS13278）購于Bioworld公司；羊抗小鼠IgG-HRP二抗（BS12478）購于Bioworld公司。免疫組化試劑：兔多克隆NF-κB抗體由Bioworld公司提供，配制成1:200工作液；SP免疫組化染色試劑盒，由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供。

2 實驗方法

2.1制備動物模型及CUR治療 48只雄性成年SPF級SD大鼠（體質(zhì)量約200g），根據(jù)IBM SPSS19.0統(tǒng)計軟件得出的隨機數(shù)表將大鼠分為正常對照組、假手術(shù)組、APE模型組和CUR治療組，每組12只。采用自體血栓復(fù)制法[7-8]制備大鼠APE動物模型，具體方法：從大鼠自身眼眶靜脈取血制成0.5mL血栓混懸液（約15～20個血栓）置于2mL注射針筒內(nèi)，并迅速注入到右頸總靜脈內(nèi)，當(dāng)大鼠明顯發(fā)紺、呼吸加深加快，則表明APE造模成功[9]。正常對照組不予任何處理，假手術(shù)組則將等量生理鹽水注入右頸總靜脈內(nèi)。手術(shù)前1天以及40min前分別對各組大鼠按設(shè)計進(jìn)行灌胃：CUR治療組給予CUR（濃度為100mg/kg）2mL，余各組予等量生理鹽水。模型建立后6、24h，CUR治療組給予2mL CUR（濃度同上）灌胃，正常對照組、假手術(shù)組和模型組均采用等量生理鹽水灌胃。栓塞后6、24h分別從各組中隨機各取6只大鼠，分別取肺組織檢測各項指標(biāo)。所有大鼠均在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度20～26℃，晝夜交替時間12h/ 12h，相對濕度40%～70%。實驗期間，動物死亡率約20%，死亡的大鼠予補充。

2.2肺組織病理學(xué)檢查 取大鼠肺組織用10%甲醛固定24h后用石蠟包埋切片，再行HE染色，最后由病理專科人員顯微鏡檢查。

2.3Western blot[1]分析NF-κB蛋白表達(dá) 分取左肺上葉，將少量組織置于勻漿器中，剪碎。加入500μL含PMSF的單去污劑裂解液于勻漿器中勻漿，使組織碾碎。再將裂解液移于1.5mL離心管中，在4℃的溫度下裂解30min，12 000rpm離心10min，取上清測定蛋白量，并于-70℃條件下保存。準(zhǔn)備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，待測樣品蛋白的加樣量為40mg/20μL/孔，電壓為100V，電泳分離。把分離出來的蛋白條帶轉(zhuǎn)到NC膜上，然后用含1.0%BSA的TBST封閉液封閉約1h。再加入稀釋的NF-κB和β-Actin抗體，室溫下孵育1h。洗膜后加入稀釋的二抗，并溫和振蕩1h?；瘜W(xué)發(fā)光顯影，據(jù)Image J軟件分析得到抗體與抗原相結(jié)合的NF-κB及β-actin特異性條帶的光密度值，并計算出NF-κB與β-actin光密度的比值。

2.4免疫組化染色測定肺組織表達(dá)的NF-κB陽性細(xì)胞數(shù) 光鏡下，每張肺片隨機取3個不重疊的視野。每只大鼠各觀察4張肺片計數(shù)陽性細(xì)胞，共得到12個數(shù)值，取平均值為一只大鼠的結(jié)果。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1各組大鼠肺組織病理 正常對照組與假手術(shù)組的肺組織無病理改變。模型組栓塞后6h見肺血栓、肺泡壁壞死和肺泡出血，有輕度至中度中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤。CUR治療組肺組織的病變較模型組減輕，肺泡壁輕至中度充血，伴輕度中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤。栓塞后24h肺組織病理，模型組有輕度中性粒細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞浸潤，而CUR治療組病變較模型組減輕。

3.2各組大鼠肺組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù) 免疫組化染色結(jié)果顯示，肺組織中NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕褐色的顆粒，在肺泡細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、支氣管平滑肌以及巨噬細(xì)胞周圍均有不同程度的表達(dá)。栓塞后6、24h，模型組NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對照組（P＜0.01），CUR治療組顯著低于模型組（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠肺組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較（） 個

表1 各組大鼠肺組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較（） 個

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

3.3各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，栓塞后6、24h，模型組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），CUR治療組顯著低于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平比較（）

表2 各組大鼠肺組織NF-κB表達(dá)水平比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別正常對照組假手術(shù)組APE模型組CUR治療組n/只6666 6h 2.25±0.93 3.11±0.75 8.52±0.05* 2.38±0.42△24h 0.52±0.02 0.54±0.02 0.70±0.04* 0.65±0.03△

4 討論

肺栓塞屬中醫(yī)“胸痹”、“喘證”、“血證”、“痰飲”等范疇。其主要病因病機是氣虛、血瘀、痰濁，治療原則是補氣、祛瘀、化痰。姜黃是CUR的母體，是中醫(yī)臨床常用藥，具破血行氣、祛瘀止痛功效，可治療氣滯血瘀型肺栓塞。我們前期研究中采用相同的大鼠APE模型，并使用不同劑量的CUR進(jìn)行治療，結(jié)果顯示CUR 100mg/kg的劑量能較好地改善APE大鼠的肺損傷[7]，故本實驗中姜黃素濃度配制為100mg/ kg。

研究表明[10]，APE存在肺動脈以及其分支的阻塞，可引起一系列炎癥反應(yīng)。NF-κB可使炎癥過程放大和持續(xù)。目前已發(fā)現(xiàn)多種NF-κB的抑制劑，然而它們副反應(yīng)較多，故未能在臨床上得以普及[11]。有研究表明[12]，小青龍湯、六君子湯、麻杏石甘湯等以補氣、化痰為主的中藥方劑可抑制NF-κB的活性。而現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)CUR有抑制炎癥反應(yīng)之作用，能抑制多種細(xì)胞因子的表達(dá)。由此我們推想，CUR是否可通過抑制NF-κB的活性從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用？本實驗中肺組織病理檢查提示典型的APE血栓及肺泡壞死出血等病理表現(xiàn)，表明該動物模型制備成功。經(jīng)CUR治療的肺組織病變減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少，提示CUR能夠改善APE大鼠肺的病理損傷，能有效治療APE大鼠。栓塞后肺組織NF-κB蛋白表達(dá)水平定性、定量檢測結(jié)果顯示，栓塞后6h及24h CUR治療組NF-κB的陽性細(xì)胞計數(shù)明顯低于模型組，接近正常對照組和假手術(shù)組。栓塞后6h和24h時，Western blot結(jié)果也支持這一點。上述結(jié)果表明，肺栓塞后NF-κB起一定的介導(dǎo)作用，參與APE后細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，而CUR通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而起治療作用。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，APE大鼠存在多種炎癥因子，CUR能夠抑制APE大鼠IL- 1β、IL-8及TNF-α等的表達(dá)水平[7,13]。故我們推測，APE后栓子進(jìn)入肺動脈，繼而引起血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的機械損傷、缺血缺氧，促使NF-κB活化，繼發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)局部產(chǎn)生炎癥因子如IL-1β、IL-8、 TNF-α等，而加重肺損傷[14-16]。而CUR通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，破壞炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，改善APE的肺部損害。

CUR可通過抑制APE大鼠肺組織中NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，破壞其炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而改善APE大鼠肺組織損傷，這可能是其干預(yù)APE的機制之一。

［1］王茜，黃俐俐，秦淑玲,等.肺通氣/灌注顯像結(jié)合血漿D-二聚體分析對肺栓塞的診斷價值［J］.中華核醫(yī)學(xué)雜志，2005，25（1）：49-51.

［2］王云祿.急性肺栓塞研究進(jìn)展［J］.臨床薈萃，2009，24（10）：916-917.

［3］Silverstein MD，Heit JA，Mohr DN，et al.Trends in the incidence of deep vein thrombosis and pulm on ary embolishm: a 25-year population-based study［J］.Arch Int ern Med，1998，158（6）：585-593.

［4］Heit JA，Cohen AT，Anderson FA.VTE Impact Assessment Group.Estimated annual number of incident and recurrent, non-fatal and fatal venous thromboembolism（VTE）events in the U.S［J］.Blood，2005，106（1）：267.

［5］陳秀梅，盧新政.2008年歐洲肺栓塞診斷治療指南解讀［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2009，30（3）：361-364.

［6］陳順華，劉小慧，康俊萍，等.冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療死亡率的性別差異［J］.中國介入心臟病學(xué)雜志，2007，15（6）：325-328.

［7］王靈聰，黃立權(quán)，孫晨，等.姜黃素對肺血栓栓塞癥大鼠肺組織不規(guī)則趨化因子的影響[J/CD].中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2011，4（6）：357-363.

［8］孫晨，王靈聰，蔣慧芳，等.阿司匹林對急性肺栓塞大鼠肺組織CX3CL1及CX3CR1影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93（1）：69-72.

［9］葉瑞海，陳少賢，王良興，等.急性自體血栓肺栓塞大鼠動物模型制備［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，36（4）：323-325.

［10］韓力，時國朝.肺血栓栓塞癥中炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的作用［J］.診斷學(xué)理論與實踐，2006，5（6）：537-540.

［11］許建英，徐永健.NF-κB在肺部炎癥性疾病中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊，2002，29（2）：60-63.

［12］張偉，張心月，邵雨萌.中醫(yī)藥對各型慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κB和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（5）：426-430.

［13］王靈聰，張微，夏國蓮，等.姜黃素對急性肺栓塞大鼠的炎癥因子影響［J］.中醫(yī)雜志，2013，54（6）：504-506.

［14］曹萍，盧啟明，薛群基，等.核因子-κB與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎［J］.國外醫(yī)學(xué)消化系統(tǒng)疾病分冊，2005，25（4）：228-230.

［15］Bhattacharyya A，Pathak S，Datta S，et al.Mitogenac tivated prote in kinases and nuclear factor-kappa Bregulate Helicobacter pylorimediated interleukin-8 release from macrophages［J］.B iochem，2002，368：121-129.

［16］崔娜娟，胡玲，勞紹賢.HSP70、NF-κB在慢性胃病脾胃濕熱證中正邪作用的探討［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（12）：1130-1132.

Effects of Curcumine on NF-κB in Acute pulmonary Embolism Rats

ZHANG Wei,WANG Lingcong.The First Affiliated Clinical Medical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310006),China

Objective To study the effects of curcumine（cur）on NF-κB in lung tissues of rats with acute pulmonary embolism（APE）.Methods Forty-eight SD healthy rats were randomly divided into 4 groups:control group, sham group,APE model,and curcumine group,with 12 rats in each group.APE model was made by autologous blood clot.At 6 h and 24 h after embolism,6 rats from each group were sacrificed to recover lung tissues for pathological examination and immunohistochemical staining of NF-κB positive cells and western blot of NF-κB expression.Results Typical thrombus and alveolar hemorrhage necrosis were seen in the pathological examination of APE rats,and curcumine reduced the damage.Immunohistochemical results showed that different levels of NF-κB were expressed in macrophages,bronchial epithelial cells,bronchial smooth muscle,and alveolar cells.At 6 h and 24 h after embolism,the count of NF-κB positive cells was obviously fewer in curcumine group than that in model group（P＜0.001）,and was not significantly different between curcumine group and control and sham groups.The level of NF-κB protein in the lung tissue was lower in curcumine group than that in model group（P＜0.01),but did not differ between curcumine group and control and sham groups.Conclusion Curcumine can lessen the damage to the lung in APE rats by inhibiting the expressions of NF-κB.

rats;pulmonary embolism;curcumine;NF-κB

2013-09-30

浙江省自然科學(xué)基金資助（No.LY12H29005）

通迅作者：王靈聰，E-mail:wlc501@139.com