周金麗 章正祥 秋 超 侯 群 浙江中藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

芎附散對偏頭痛模型大鼠行為學(xué)、血漿CGRP和NO的影響

周金麗 章正祥 秋 超 侯 群 浙江中藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

目的 觀察芎附散對硝酸甘油誘發(fā)的偏頭痛模型大鼠行為學(xué)、血降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和一氧化氮（NO）的影響。方法 將72只健康雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、鹽酸氟桂利嗪組和芎附散組，每組18只，連續(xù)灌胃8天后，除空白對照組外，其余各組大鼠予以頸部皮下注射硝酸甘油復(fù)制實驗性偏頭痛模型。觀察各組大鼠行為學(xué)變化1h，分別于1、2、4h三個時間點采集腹主動脈血測定CGRP和NO水平。結(jié)果 空白對照組、鹽酸氟桂利嗪組和芎附散組大鼠1h行為學(xué)表現(xiàn)與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战M、鹽酸氟桂利嗪組和芎附散組大鼠1、2h兩個時間點血CGRP水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但三組4h血CGRP水平顯著低于模型組（P＜0.05）。三組大鼠各時間點動脈血NO水平均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論 芎附散可減輕由硝酸甘油誘發(fā)的偏頭痛模型大鼠癥狀，降低其血管活性物質(zhì)CGRP和NO水平。

大鼠；偏頭痛；芎附散；降鈣素基因相關(guān)肽；一氧化氮

芎附散出自《丹溪心法》，由川芎、香附兩味藥組成。川芎辛溫香燥，走而不守，既能行散，上行可達巔頂；又入血分，下行可達血海?；钛铕鲎饔脧V泛，適宜瘀血阻滯各種病癥；該方祛風(fēng)止痛，效用甚佳，可治頭風(fēng)頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥。昔人謂川芎為血中之氣藥，殆言其寓辛散、解郁、通達、止痛等功能。香附辛微苦甘、平，入肝、三焦經(jīng),具有理氣解郁、調(diào)經(jīng)止痛功效。芎附散臨床廣泛用于偏頭痛治療，但其作用機制尚不完全清楚。本實驗?zāi)Ｐ陀^察芎附散對硝酸甘油偏頭痛大鼠行為學(xué)及血漿降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和一氧化氮（NO）含量的影響，探討該藥治療偏頭痛的作用機制。

1 實驗材料

1.1動物與分組 正常SPF級SD雄性大鼠72只，平均體質(zhì)量（300±50）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（滬）2008-0016。應(yīng)用隨機數(shù)字表進行完全隨機化分為空白對照組、模型組、鹽酸氟桂利嗪組和芎附散組，每組18只，連續(xù)灌胃第8天后每組再隨機分為3個亞組，各6只，每個亞組分別作為1、2、4h三個時間點取材。

1.2藥品與儀器 芎附散（川芎∶香附=3∶1，陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，試驗用劑量3.6mg/kg）；鹽酸氟桂利嗪膠囊（批號120608496，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，試驗用劑量0.9mg/kg）；硝酸甘油注射液（批號120709，廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)，試驗用劑量10mg/kg）；戊巴比妥鈉（批號020819，北京化學(xué)試劑公司，德國進口分裝，試驗用劑量50mg/kg）；NO試劑盒（E1030，普利萊基因技術(shù)有限公司提供）；CGRP放免分析試劑盒（北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司提供）；酶標測試儀（ELX808）、-70℃超低溫冰箱（702型）及-20℃冰箱（均為BIOTEK公司生產(chǎn)）。

2 實驗方法

2.1給藥方法 各組均給藥8天，每天灌胃1次，給藥容積為1mL/100g。鹽酸氟桂利嗪組和芎附散組按各自相應(yīng)濃度的溶液灌胃；空白對照組和模型組均每天灌胃生理鹽水1mL/100g。實驗過程遵循實驗動物管理條例（1988年2號令）。

2.2偏頭痛模型制作 第8天給藥后30min，模型組、鹽酸氟桂利嗪組、芎附散組大鼠頸部皮下注射硝酸甘油0.2mL/100g（10mg/kg），復(fù)制實驗性偏頭痛動物模型[1]，空白對照組頸部皮下注射等量生理鹽水。

2.3行為學(xué)觀察 參考朱曉鳳等制定的評分標準[2]：①理毛動作：10次=1分（以10次為基數(shù)，每增加1次，加0.1分）；②圍籠打轉(zhuǎn)：2次=1分（每增加1次，加1分）；③爬籠：3次=1分（每增加1次，加1分）；④煩躁：往返運動1次=1分；⑤咬尾：1次=1分；⑥耳紅：出現(xiàn)為1分。

2.4血漿CGRP和NO含量測定 硝酸甘油造模后1、2、4h大鼠予戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，分別取兩份2mL腹主動脈血，將其中一份2mL血注入含有7.5%EDTA二鈉30μL和抑肽酶40μL的冰冷離心試管中，輕輕搖勻，常溫離心機，3000r/min，離心5min，分離出抗凝血漿，按編號放入超低溫冰箱中-70℃保存，用于CGRP檢測；將另一份2mL血注入離心試管中，靜置0.5h，常溫離心機，3000r/min，離心10min，分離出血清，按編號放入-20℃低溫冰箱中貯存用于NO檢測。血漿CGRP以放免法測定，NO以可見光分光光度法測定，操作均按試劑盒說明書進行。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以（） 表示，組間進行單因素方差分析、SNK多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1行為學(xué)變化 空白對照組、鹽酸氟桂利嗪組及芎附散組1h行為學(xué)得分與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠1h行為學(xué)評分比較（） 分

表1 各組大鼠1h行為學(xué)評分比較（） 分

注：與模型組比較，*P＜0.05

空白對照組模型組鹽酸氟桂利嗪組芎附散組18 18 18 18 3.20±0.74* 40.60±6.44 12.56±5.68* 10.47±4.30*

3.2各組血漿CGRP水平比較 空白對照組、鹽酸氟桂利嗪組1、2h動脈血漿CGRP水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；芎附散組2h CGRP與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組4h時間點血漿CGRP水平均顯著低于模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠各時間點血漿CGRP水平比較（） pg/mL

表2 各組大鼠各時間點血漿CGRP水平比較（） pg/mL

注：與模型組比較，*P＜0.05

3.3各組血清NO水平比較 與模型組各時間點比較，空白對照組、鹽酸氟桂利嗪組、芎附散組各時間點大鼠血清中NO含量明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠各時間點血漿NO含量（） μmol/L

表3 各組大鼠各時間點血漿NO含量（） μmol/L

注：與模型組比較，*P＜0.05

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4 討 論

偏頭痛發(fā)病機制迄今尚不完全清楚。目前認為它是一種對于體內(nèi)或體外環(huán)境的突然變化發(fā)生的神經(jīng)血管反應(yīng)，與體內(nèi)多種血管活性物質(zhì)如降鈣素基因相關(guān)肽、一氧化氮、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NA）、多巴胺（DA）、P物質(zhì)及神經(jīng)肽A等密切相關(guān)[3]，神經(jīng)源性炎癥使血管擴張、血漿成分外滲、肥大細胞脫顆粒和血小板激活。感覺傳入纖維進一步興奮，加重神經(jīng)源性炎癥，并興奮腦干、下丘腦和大腦皮質(zhì)等高級中樞引發(fā)頭痛。

硝酸甘油動物偏頭痛模型方法簡單、經(jīng)濟，可在短期內(nèi)復(fù)制[4-5]，其代謝產(chǎn)物NO兼有內(nèi)源性血管擴張劑和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重功能，可促進三叉神經(jīng)傷害感覺器的中樞致敏作用，并可誘導(dǎo)三叉神經(jīng)節(jié)細胞合成和分泌降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）。CGRP廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管、消化、呼吸和內(nèi)分泌等系統(tǒng)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強血管擴張藥物，而其對腦、心血管的作用更為顯著。近年研究發(fā)現(xiàn)，CGRP是偏頭痛的一個重要因素[6]，CGRP和P物質(zhì)是支配腦血管的三叉神經(jīng)感覺纖維中兩種主要的神經(jīng)肽。三叉神經(jīng)感覺纖維釋放CGRP，CGRP擴張血管并使毛細血管通透性增加、血漿蛋白滲出，增強P物質(zhì)在外周的擴血管、血漿滲出、刺激各種炎癥介質(zhì)釋放和聚集作用，共同形成神經(jīng)源性炎癥，引起劇烈疼痛反應(yīng)[7]。

盡管偏頭痛中醫(yī)臨床診斷標準不一[8]，但是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)驗開發(fā)的一些中藥，如天麻素、芎附散在實踐中大量運用。芎附散中的川芎對中樞神經(jīng)具有鎮(zhèn)痛作用，其所含成分能改善微循環(huán)，抑制血小板聚集，有較強的鎮(zhèn)痛、解痙、軟化血管作用，而且能通過血腦屏障，對急、慢性腦血管疾病有肯定療效[9]。本研究結(jié)果表明，模型組血管活性物質(zhì)CGRP、NO含量明顯升高，這與國內(nèi)外實驗結(jié)果基本一致[10]，芎附散能明顯減少動物的陽性反應(yīng)次數(shù)，降低模型大鼠各時間點血CGRP和NO的含量，提示該藥物能通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，減少致痛致炎物質(zhì)、血管活性物質(zhì)的釋放，降低神經(jīng)細胞、腦血管的進一步損傷，緩解神經(jīng)源性炎癥，提高機體痛閾值，緩解或預(yù)防偏頭痛的發(fā)生。

［1］Tassorelli C，Joseph SA.Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat［J］.Brain Res，1995，682（1-2）：167-181.

［2］朱曉鳳，韓月臣，熊文萍，等.熱凝腦膜中動脈對硝酸甘油致偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)尾核c-fos基因表達的影響［J］.山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報，2010，24（1）：61-64.

［3］劉若卓，于生元.偏頭痛發(fā)病機理的研究進展［J］.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（4）：225-228.

［4］郭琳，洪治平.硝酸甘油型實驗性偏頭痛模型原理與研究現(xiàn)狀［J］.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（6）：357-359，364.

［5］李佳川，孟憲麗，曾勇.偏頭痛動物模型研究現(xiàn)狀［J］.中藥與臨床，2010，1（4）：56-60.

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［7］Perini F，D'Andrea G，Galloni E，et al.Plasma cytokine levels in migraineurs and controls［J］.Headache，2005，45（7）：926-931.

［8］馬壯壯，梁茂新.偏頭痛中醫(yī)辨證存在問題與對策［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：412-414.

［9］黃力強.川芎對心腦血管疾病活血化瘀藥理作用的探討［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2000，27（10）：469-469.

［10］齊廣平.桂枝去桂加茯苓白術(shù)湯對實驗性偏頭痛動物模型NO、CGRP含量的影響［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2010，31（35）：6419-6420.

Influence of Xiongfu Powder on Behavioral Manifestations and Plasma Calcitonin-gene Related Peptide and Nitric Oxide Levels in Migraine Rats Triggered by Nitroglycerin

ZHOU Jinli,ZHANG Zhengxiang,QIU Chao,HOU Qun. The First Affiliated Clinical Medical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310053),China

Objective To observe the influence of Xiongfu powder on the behavioral manifestations and blood calcitonin-gene related peptide（CGRP）and nitric oxide（NO）levels in migraine rats.Methods Seventy-two SD rats were randomly divided into four groups:blank control group,model group,flunarizine hydrochloride group,and Xiongfu powder group.By intragastric administration for 8 consecutive days,the rats were injected subcutaneously with nitroglycerin to trigger migraine except for blank control group on day 8 and then abdominal aorta blood from the rats was drawn at 1,2,and 4 h after drug intervention to detect CGRP and NO levels.One-hour behavioral manifestations were observed after drug intervention.Results One-hour behavioral manifestations were significantly different in blank control,flunarizine hydrochloride,and Xiongfu power groups compared with the model group（P＜0.05）.The CGRP level in blank control,flunarizine hydrochloride,and Xiongfu powder groups was markedly lower than that of model group at 4 h after drug intervention（P＜0.05）,but no statistical difference was found between the three groups and model group at 1 and 2 h（P＞0.05）.The No levels in the 3 groups were much lower than that in model group at each time point（P＜0.05）.Conclusion Xiongfu powder may relieve symptoms of rats following nitroglycerin infusion,meanwhile may reduce the CGRP and NO levels.

rats;migraine;Xiongfu powder;calcitonin-gene related peptide;nitric oxide

2013-06-11

侯群，Tel：13588887283；E-mail：houqun168@163.com