陳 偉張慧芳

1浙江省富陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房 富陽 311400 2金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院

·藥學(xué)園地·

杭菊葉總黃酮含量測定

陳 偉1張慧芳2

1浙江省富陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房 富陽 311400 2金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院

杭菊葉；黃酮；含量

杭菊又稱杭白菊，是菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序[1]，是著名的“浙八味”之一，杭白菊為藥食同源藥材，需求量大，但在采摘菊花的同時，大量的菊葉被丟棄，造成較大浪費。中醫(yī)認(rèn)為，菊花葉性平，味辛、甘，具有清肝明目，解毒消腫的功效，主要用于頭風(fēng)、目眩、疔瘡、癰腫等癥[2]，具有較高的藥用價值。已有文獻(xiàn)報道亳菊葉、野菊葉等含有黃酮等多種有效成分[3-6]，但對杭菊葉中所含的黃酮類成分的含量未見報道。浙江為杭菊葉道地產(chǎn)地，主產(chǎn)于桐鄉(xiāng)等地，杭菊葉資源豐富，為了合理開發(fā)和綜合利用杭菊葉，本文對杭菊葉中總黃酮進(jìn)行了測定，為深入研究和綜合利用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1試劑與藥材 蘆丁（中國藥品生物制品檢定所，批號100080-201002）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉為分析純（國藥集團(tuán)試劑公司）。杭菊葉：2013年秋季采于浙江桐鄉(xiāng)，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院羅國海副教授鑒定為菊科植物 Chrysanthemum morifolium Ramat.的新鮮葉，60℃烘干，粉碎。同時采集同株的杭白菊，同法處理。

1.2儀 器 VU-265 FM紫外可見分光光度計（日本島津），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），XP205電子分析天平（瑞士梅特勒托利多）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1對照品溶液制備 稱取蘆丁對照品約30mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，即得。每1mL中含無水蘆丁0.299mg。

2.2供試溶液制備 取杭菊葉粉末約0.2g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇20mL，稱重，回流提取60min，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

精密吸取供試品溶液1mL，分別置25mL量瓶中，照“2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項下的方法，自“加70%乙醇至6mL”起依法測定吸光度，計算含量。

2.3線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL，分別置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外-可見分光光度法（2010版中國藥典一部附錄ⅤA），于510nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得吸光度Y與蘆丁濃度X的回歸方程：Y=9.447X+0.046，r=0.9997，線性范圍為0.299～2.093mg。

2.4提取工藝優(yōu)選 影響杭菊葉總黃酮提取的主要因素有提取方法、乙醇濃度、溶劑用量和提取時間等，因此對四個因素進(jìn)行單因素考察。

2.4.1提取方法的考察 取杭菊葉粉末約0.2g，精密稱定，分別置50mL圓底燒瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱重，分別超聲和回流提取60min，放涼，稱重，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液，依法測定。

超聲提取測定結(jié)果為6.49%，回流提取為8.41%，結(jié)果表明，回流提取的黃酮含量高于超聲提取，因此選擇回流為杭菊葉總黃酮提取方法。

2.4.2乙醇濃度考察 取杭菊葉粉末約0.2g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，分別精密加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%濃度的乙醇20mL，稱重，回流提取，放涼，稱重，用相應(yīng)濃度的乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進(jìn)行測定。結(jié)果乙醇濃度在50%～80%范圍內(nèi)時，測得總黃酮含量較高，且乙醇濃度為70%時，測得的總黃酮含量最高，為9.63%。因此，確定提取溶劑為70%乙醇。見表1。

表1 不同濃度乙醇總黃酮提取測定結(jié)果

表2 不同溶劑用量提取測定結(jié)果

表3 回收率試驗結(jié)果

2.4.3溶劑用量考察 取杭菊葉粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，分別精密加入70%乙醇10、15、20、25和30mL，稱重，分別回流提取1h，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進(jìn)行測定。結(jié)果當(dāng)溶劑超過20mL時，總黃酮含量變化不大。因此，確定提取溶劑用量為20mL。見表2。

2.4.4提取時間考察 取杭菊葉粉末四份，各約0.2g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇各20mL，稱重，分別回流提取0.5、1、1.5和2h，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進(jìn)行測定。

提取0.5h測定結(jié)果為7.86%，1h為9.63%，1.5h為9.81%，2h為9.79%，結(jié)果表明，隨著回流時間的延長，測定結(jié)果增高，當(dāng)回流時間＞1h時，總黃酮含量測定結(jié)果變化不明顯，綜合考慮將提取時間確定為1h。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗 精密吸取對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，照“2.3線性關(guān)系考察”項下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，測定吸光度，測定六次。對照品溶液及供試品溶液吸光度的RSD分別為0.48%和0.69%，表明精密度良好。

2.5.2穩(wěn)定性試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，照“2.3線性關(guān)系考察”項下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，每隔5min測定一次吸光度。對照品溶液及供試品溶液30min內(nèi)吸光度的RSD分別為2.22%和2.39%，RSD均＜3%，結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液顯色后在30min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3重復(fù)性試驗 分別取杭菊葉粉末6份，照“2.2供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進(jìn)行測定，測得總黃酮含量平均值為9.65%，RSD值為2.30%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4加樣回收率試驗 采用加樣回收法試驗。取已知總黃酮含量的杭菊葉0.1g，精密稱定，共取6份，分別準(zhǔn)確加入蘆丁對照品適量，照“2.2供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，制備成供試品溶液，照前述含量測定方法進(jìn)行測定，計算回收率。試驗結(jié)果表明，蘆丁平均回收率為101.2%（n= 6），RSD為2.7%。說明該測定方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)果見表3。

2.6樣品測定 分別稱取杭菊葉、杭白菊粉末三份，每份0.2g，精密稱定，照“2.2供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進(jìn)行測定。見表4。

表4 傳統(tǒng)加工及硫熏加工杭菊葉總黃酮含量測定結(jié)果

3 結(jié) 論

杭白菊在采收過程中，只利用了植株的很少部分，大量的杭菊葉棄之不用，通過對杭菊葉和同株花朵總黃酮含量的測定發(fā)現(xiàn)，杭菊葉中總黃酮含量高于杭白菊，因此，杭菊葉具有較大的開發(fā)利用潛力。

黃酮在很多天然藥物中均有分布，具有廣泛的藥理活性，是天然藥物開發(fā)利用研究的熱點，杭菊葉中黃酮含量較高，但所含黃酮的種類是否和花相同，主要黃酮成分含量多少以及杭菊葉黃酮的藥效作用如何均未見報道，因此，在進(jìn)一步的工作中應(yīng)進(jìn)行相關(guān)研究，為杭菊葉的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：292.

［2］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.第七冊.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：810.

［3］任愛農(nóng)，鞠建明.野菊不同部位的總黃酮含量測定［J］.中草藥，1999，30（8）：589.

［4］何小珍，郭玉，徐小娜，等.野菊不同部位綠原酸和3，5-二咖啡?？鼘幩岬暮繙y定［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：72-75.

［5］何小珍，賀冬秀，喻翠云，等.野菊葉中綠原酸及木犀草素-7-O-葡萄糖苷測定［J］.南華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，24（4）：95-98.

［6］陳慧芳，吳德玲，金傳山，等.正交設(shè)計優(yōu)選亳菊葉總黃酮提取工藝［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，20（2）：67-69.

修回日期：2014-03-24

2014-02-12