陳彩珍，盧 健，季 瀏

（1.華東師范大學青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，上海200241；2.華東師范大學體育與健康學院，上海200241）

?運動人體科學

不同運動方式對小鼠骨骼肌肌萎縮相關(guān)因子表達的影響

陳彩珍1，2，盧 健1，2，季 瀏1，2

（1.華東師范大學青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，上海200241；2.華東師范大學體育與健康學院，上海200241）

目的：運動能夠引起骨骼肌肥大，防止肌萎縮的發(fā)生。骨骼肌在萎縮狀態(tài)下泛素蛋白酶通路被激活，旨在通過檢測蛋白降解途徑中幾個關(guān)鍵因子mRNA的表達，探討不同的運動形式對抗骨骼肌萎縮的效果及機制。方法：選取21只雄性老年SAMP8小鼠，隨機分為對照組（C）、耐力訓練組（E）、抗阻訓練組（R）。經(jīng)過8周的訓練后，檢測小鼠右側(cè)腓腸肌橫截面積及MuRF-1、MAFbx、Caspase-3和IGF-1mRNA表達。結(jié)果：耐力訓練和抗阻訓練大鼠腓腸肌MuRF-1、MAFbx和Caspase-3 mRNA表達均顯著高于對照組，但兩訓練組間無顯著性差異；IGF-1mRNA的表達兩訓練組亦顯著高于對照組，且抗阻訓練組顯著高于耐力訓練組，抗阻訓練組的腓腸肌纖維面積顯著高于對照組和耐力訓練組。結(jié)論：抗阻訓練在維持肌質(zhì)量方面效果優(yōu)于耐力訓練。兩種不同的運動方式對腓腸肌質(zhì)量影響之差異可能不僅僅是通過泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)，還與IGF-1介導的骨骼肌再生有關(guān)。

肌萎縮；泛素蛋白酶體途徑；IGF-1；MuRF-1；MAFbx；Caspase-3；耐力訓練；抗阻訓練

老年性肌肉萎縮是衰老過程出現(xiàn)的一種退行性變化，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，也是一些慢性疾病的誘發(fā)原因，但改善肌肉質(zhì)量一直得不到重視。除了營養(yǎng)物質(zhì)的改善之外，運動或機械刺激是改善骨骼肌功能的最主要方式。運動能夠引起骨骼肌肥大，預防肌萎縮的發(fā)生。運動引起骨骼肌肥大的機制已有近百年的研究歷史，并且一直是備受運動醫(yī)學界關(guān)注的熱點課題。機制雖未闡明，但有研究表明在肌萎縮中存在蛋白質(zhì)代謝失衡，這與肌肉內(nèi)泛素-蛋白酶體有密切關(guān)系［1-3］。在這一過程中泛素連接酶MAFbx和MuRF1是關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］，它們結(jié)合并介導特異性底物的泛素化。在各種肌萎縮模型中，MAFbx和MuRF1表達上調(diào)［5］。運動訓練能否通過影響泛素蛋白酶體相關(guān)因子的表達、減少蛋白質(zhì)的分解來達到延緩肌肉衰減的目的，且何種運動方式延緩肌肉衰減的效果更好，目前尚鮮見報道。為此本實驗研究長期的抗阻訓練和耐力訓練對老年小鼠蛋白降解過程中關(guān)鍵因子MuRF-1、MAFbx、Caspase-3 mRNA表達變化的影響，以探尋運動訓練改善肌質(zhì)量的可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡SAMP8小鼠21只，購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心（實驗動物飼養(yǎng)許可證編號：W-J津?qū)崉淤|(zhì)M準字第006號）。隨機分為3組，分別為對照組（C）、耐力訓練組（E）、抗阻訓練組（R）、每組7只。在IVC獨立送風飼養(yǎng)系統(tǒng)中分籠飼養(yǎng)，每日自由飲水，喂食標準飼料，12 h光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度40%～60%。

1.2 運動方案

耐力運動：8周跑臺訓練?？棺柽\動：尾部負重爬梯訓練，爬梯為1 m高，每級梯階間隔1.5 cm，傾斜85°。訓練時小鼠被放置于爬梯裝置的底部，進行爬梯訓練。具體訓練方案見表1。

表1 8周漸增強度耐力、抗阻運動訓練方案

1.3 主要試劑和儀器

試劑：TRIzol Reagent，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司），Goldview（上海賽百盛），Loading bueffer（天根生化科技有限公司），RNA酶抑制劑，Oligo dT15 primer，dNTP Mix（TaKaRa），Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）

儀器：IVC獨立送風飼養(yǎng)系統(tǒng)（杭州紹豐公司），立式高速冷凍離心機（Beckman），Step One Real-time PCR儀（ABI），水平／垂直電泳槽，穩(wěn)壓電泳儀，PCR儀（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech），石蠟包埋機、冰凍切片機、石蠟烤片機（LEICA）。

1.4 樣本的采集

末次運動后24 h，將實驗鼠稱重，斷頭處死。迅速取小鼠右側(cè)腓腸肌，經(jīng)預冷PBS緩沖液沖洗干凈，稱重，分為3部分（錫紙包裹），腓腸肌中部置入新鮮配置的10%甲醛中固定備石蠟切片，剩余部分暫置液氮保存后放置-80℃超低溫冰箱中待RT-PCR檢測。

1.5 骨骼肌纖維橫截面積的測量

腓腸肌固定后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后常規(guī)制作厚6μm的石蠟切片，采用蘇木精伊紅法進行染色并拍照，Leica Qwin軟件統(tǒng)計肌纖維橫截面積、直徑。

1.6 樣品RNA的抽提及總RNA的質(zhì)量和純度檢測

Trizol法提取樣本總RNA，經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示清晰的28 S、18 S、5 s條帶（圖1所示），核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA A260／A280＞1.8，提示總RNA完整性和質(zhì)量較好。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

1.7 逆轉(zhuǎn)錄

反應體系的總體積為20μl，DEPC水8μl，RNA酶抑制劑（50 U／μl）0.5μl，隨機引物（50 pM／ul）2 μl，RNA 2μg，65℃水浴處理5 min，室溫放置10 min，高速（高于5 000 g）離心5 s。繼續(xù)加入反應物：RNA酶抑制劑（50 U／μl）0.5μl，5 xbuffer 4μl，dNTPMIX（1 omM／each）2μl，DTT 2μl，M-MLV（200 Uu／l）1μl。37℃水浴1 h，90℃處理5～10 min，冰浴5 min，高速（高于5 000 g）離心5 s。

1.8 引物設(shè)計與合成

通過genebank查到大鼠MuRF-1 mRNA、MAFbx mRNA和Caspase-3 mRNA序列，用Primer Express 3.0自行設(shè)計引物序列，由上海捷瑞生物有限公司合成（表2）。用β-actin作為“管家基因”（house keeping gene），用以監(jiān)控總RNA使用量，以消除不同樣本間加樣誤差。

表2 檢測基因的引物序列及RT-PCR反應條件

1.9 熒光定量RT-PCR檢測

按照SYBR?Green Premix Kit說明書配制反應體系，反應條件為：預變性95℃3 min；45個循環(huán)（95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s），95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s。

1.10 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS11.5 for Windows）處理，單因素方差分析。以P＜0.05為差異顯著性標準，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 訓練前后各組小鼠體重比較

實驗前后各組小鼠體重組間無顯著性差異（P＞0.05）；訓練后各組小鼠體重相對于訓練前有下降趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）（表3）。

表3 訓練前后各組SAMP8小鼠的體重比較

2.2 小鼠腓腸肌肌濕重體重比及肌纖維橫截面積檢測

由表4可見，抗阻訓練組腓腸肌濕重／體重比值（RM）極顯著高于對照組，（P＜0.01），亦顯著高于耐力訓練組（P＜0.05）。與對照組比較，抗阻訓練組小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積有極顯著性增大（P＜0.01）；抗阻訓練組亦顯著高于耐力訓練組（P＜0.05）。

2.3 運動對小鼠腓腸肌MAFbx、MuRF-1 mRNA表達的影響

由表5可見，與對照組比較，耐力訓練和抗阻訓練組小鼠腓腸肌MAFbx mRNA的表達呈顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。2個訓練組MuRF-1 mRNA的表達水平亦明顯低于對照組，具有極顯著性差異（P＜0.01）。

表4 小鼠腓腸肌肌濕重體重比（RM）及肌纖維橫截面積（CSA）

圖2 各組小鼠腓腸肌纖維橫截面積照片（×40）

表5 小鼠腓腸肌MAFbx、MuRF-1 m RNA的表達

2.4 運動對小鼠腓腸肌Caspase-3和IGF-ImRNA表達的影響

由表6可見，耐力訓練和抗阻訓練組小鼠骨骼肌Caspase-3 mRNA的表達水平明顯低于對照組（P＜0.01，P＜0.05）；而IGF-ImRNA的表達明顯高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），兩訓練組之間比較，抗阻訓練組IGF-ImRNA水平顯著高于耐力組。

表6 小鼠腓腸肌Caspase-3、IGF-Im RNA的表達

3 討論

衰老過程中肌質(zhì)量和力量的漸進性下降（sarcopenia）嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，增加致病率和致死率。骨骼肌質(zhì)量的維持取決于蛋白質(zhì)合成和降解的平衡。因此，sarcopenia可能是由于復雜的多因素的影響下肌肉蛋白合成降低，或肌肉蛋白降解程度增強，或者兩者兼而有之的持續(xù)的變化過程［6］。肌肉蛋白質(zhì)降解有兩條主要途徑，即泛素蛋白酶體途徑（ubiquit proteasome system，UPs）和溶酶體自噬途徑［2］。其中泛素蛋白酶體途徑是一種ATP依賴的非溶酶體蛋白降解途徑，可高效并高度選擇性地降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，尤其是短壽命的功能蛋白，應激狀態(tài)下也降解細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白。整個體系包括泛素分子對底物的識別、靶蛋白的降解等步驟。它是肌原纖維蛋白溶解的最主要方式，最近研究發(fā)現(xiàn)泛素蛋白連接酶肌環(huán)指蛋白1（MuRF1）、肌萎縮F-box（MAFbx）是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。它們特異性地在心肌和骨骼肌中表達，并在多種肌萎縮模型中表達增強。MuRF1過度表達后，可以破壞titin與其結(jié)合的部位，提示MuRF1能調(diào)節(jié)這一結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定性［8］。與野生型小鼠比較，MAFbx-／-或MuRF1 -／-小鼠在肌肉失神經(jīng)后表現(xiàn)出對抗肌萎縮。這些研究顯示MAFbx和MuRF-1的表達是泛素蛋白酶體途徑致肌萎縮的敏感且可信的標志物。在細胞培養(yǎng)或嚙齒類動物的研究中均發(fā)現(xiàn)MAFbx和MuRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是受IGF-1／Akt信號途徑控制的［9］。然而，人們對衰老過程中肌纖維泛素蛋白酶途徑介導的蛋白降解調(diào)節(jié)機制所知仍有限，并有爭議。如有報道在衰老過程中編碼泛素蛋白酶體系組分的mRNA水平無顯著升高，蛋白酶體特異性活性甚至減弱［10］。而Cai等人發(fā)現(xiàn)在衰老嚙齒動物和人快肌中泛素蛋白水平大幅提高［11］。因此，泛素蛋白酶途徑在衰老過程中是被抑制還是被激活仍不清楚。

運動訓練能夠增加骨骼肌的質(zhì)量和力量，改善與肌萎縮相關(guān)的細胞和分子水平的變化。運動訓練作為一種重要的肌肉衰減防治機制被廣泛應用，但是其肌萎縮防治的確切機制仍不明確。不同形式的運動如有助于提高心肺機能的耐力運動和有助于改善肌肉功能的抗阻運動在延緩sarcopenia的發(fā)生發(fā)展方面效果如何？弄清其機制對于改善老年機體的機能有實質(zhì)性意義。

本研究通過對老年SAMP8小鼠進行為期8周的訓練，發(fā)現(xiàn)耐力訓練鼠腓腸肌肌纖維橫截面積較對照組有增大的趨勢，但無顯著性差異；而抗阻訓練鼠肌纖維橫截面積明顯大于耐力訓練組和對照組，有顯著性差異。Yarasheski等通過對老年人進行6個月的不同強度的抗阻訓練后發(fā)現(xiàn)，抗阻訓練能夠減少氧化應激，并提供一個潛在的預防細胞老化和sarcopenia的保護性效果?？棺栌柧毮軌蚰孓D(zhuǎn)在衰老過程中骨骼肌總蛋白的轉(zhuǎn)換［12］。Zoltan等對SD大鼠進行6個月的跑臺訓練，青年鼠與老年鼠以相同的速度每天訓練1 h，每周5天，訓練6個月后發(fā)現(xiàn)，訓練并沒有改變青年鼠腓腸肌和跖肌的質(zhì)量。而24月齡的老年運動組和對照組骨骼肌質(zhì)量丟失分別為16%和19%。這一結(jié)果提示，每天1 h有規(guī)律的耐力運動并不能阻止衰老過程中骨骼肌質(zhì)量的丟失，但可以延緩或者減小肌肉丟失的速率［13］。顯然，在改善肌肉體積和質(zhì)量方面抗阻訓練有其突出的優(yōu)勢。

本研究進一步觀察了8周耐力訓練和抗阻訓練鼠腓腸肌MAFbx和MuRF-1的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)其mRNA的表達明顯下調(diào)，但兩個訓練組之間無顯著性差異（P＞0.05）。似乎這兩種不同的運動方式對腓腸肌質(zhì)量影響之差異并不是通過泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)的。而Chen等報道8周耐力訓練抗肌肉萎縮的效果可能是通過抑制氧化應激誘導的MURF-1表達，阻止MURF-1介導的MHC（肌球蛋白重鏈）降解來實現(xiàn)的［14］。為了進一步探尋原因，本研究觀察了UPS上游的蛋白水解酶Caspase-3，發(fā)現(xiàn)耐力訓練和抗阻訓練小鼠Caspase-3mRNA的表達變化趨勢與MAFbx和MuRF-1的一致，即在兩種不同的訓練方式中Caspase-3的轉(zhuǎn)錄水平較對照組明顯下調(diào)，兩訓練組間亦無顯著性差異。提示抗阻訓練有效增大肌肉的體積并不是由于蛋白水解減少導致的，而可能是通過蛋白合成的增強。當然，不管是抗阻訓練還是耐力訓練均能通過Caspase-3、MAFbx和MuRF-1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)減緩骨骼肌質(zhì)量隨增齡的丟失，不過抗阻訓練還通過蛋白合成的增強而更傾向于正平衡。

有研究證實IGF-1通過Akt的活化而下調(diào)MAFbx和MuRF-1的表達［9］。在衰老鼠骨骼肌中IGF-1mRNA和活化的Akt均處于較低的水平從而解除對MAFbx和MuRF-1的抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)MAFbx能促進蛋白酶體對MyoD（肌分化因子）的降解，MAFbx在成肌細胞中的過表達可抑制肌管的形成［15］。因此推測MAFbx的表達上調(diào)通過加強MyoD的降解參與了衰老過程中骨骼肌發(fā)生的下降及再生能力的下降。這可能是引起Sarcopenia的原因之一。Musaro亦發(fā)現(xiàn)骨骼肌IGF-1的過表達有利于保存肌質(zhì)量和再生潛能［16］。本研究亦觀察了耐力訓練和抗阻訓練對小鼠腓腸肌IGF-1mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)8周訓練后，無論是耐力訓練組還是抗阻訓練組腓腸肌IGF-ImRNA的表達均有顯著性增加，且抗阻訓練組增加幅度更大，表明IGF-I在抗阻訓練導致的腓腸肌肥大中有著更敏感的應答反應。

4 小結(jié)

肌質(zhì)量的維持靠分解和合成因子的平衡。IGF-1通過相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路抑制MAFbx和MuRF-1的表達，控制Caspase-3及UPS途徑相關(guān)組分的轉(zhuǎn)錄活性?？棺栌柧毢湍土τ柧毦茉谝欢ǔ潭壬仙险{(diào)IGF-1基因表達，下調(diào)Caspase-3、MAFbx和MuRF-1mRNA表達，延緩Sarcopenia的發(fā)生或發(fā)展進程?？棺栌柧氃诰S持肌質(zhì)量方面效果優(yōu)于耐力訓練。具體機制有待進一步研究。

［1］Kavita P Bhat，Susanna F Greer.Proteolytic and non-proteolytic roles of ubiquitin and the ubiquitin proteasome system in transcriptional regulation［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2011，1809：150-155.

［2］Mammucari C，Schiaffino S，Sandri M.Downstream of Akt：FoxO3 and mTOR in the regulation of autophagy in skeletalmuscle［J］. Autophagy，2008，4（4）：524-526.

［3］Zhao J，Brault JJ，Schild A，et al.Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by FoxO transcription factor［J］.Autophagy，2008，4（3）：378-380.

［4］Jones A，Hwang DJ，Narayanan R，et al.Effects of a novel selective androgen receptormodulator on dexamethasone-induced and hypogonadism-induced muscle atrophy［J］.Endocrinology，2010，151（8）：3706-3712.

［5］Chen YW，Gregory CM，Scarborough MT，etal.Transcriptional pathways associated with skeletalmuscle disuse atrophy in humans［J］. Physiol Genomics，2007，31（3）：510-520.

［6］Benjamin TWall，Marlou LDirks，Luc JC van Loon.Skeletalmuscle atrophy during short-term disuse：Implications for age-related sarcopenia［J］.Ageing Research Reviews，2013，12：898-906.

［7］Suguru Koyama，Shoji Hata，Christian CWitt，et al.Muscle RING-finger protein-1（MuRF1）as a connector ofmuscle energymetabolism and protein synthesis［J］.JMol Biol，2008，376：1224-1236.

［8］Misako Jogo，Seiji Shiraishi，Taka-aki Tamura.Identification of MAFbx as amyogenin-engaged F-box protein in SCF ubiquitin ligase［J］.FEBS Letters，2009，583：2715-2719.

［9］Sandri M，Sandri C，Gilbert A，et al.Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletalmuscle atrophy［J］.Cell，2004，117：399-412.

［10］Ferrington DA，Husom AD，Thompson LV.Altered proteasome structure，function，and oxidation in aged muscle［J］.FASEB J，2005，19：644-646.

［11］Cai D，Lee KK，Li M，et al.Ubiquitin expression is up-regulated in human and rat skeletalmuscles during aging［J］.Arch.Biochem. Biophys，2004b，425：42-50.

［12］Yarasheski KE，Pak-Loduca J，Hasten DL，etal.Resistance exercise training increases mixed muscle protein synthesis rate in frail women and men≥76 yr old［J］.Am JPhysiol，1999，277：E118-E125.

［13］Zoltan Bori，Zhongfu Zhao，Erika Koltai，et al.The effects of aging，physical training，and a single boutof exercise onmitochondrial protein expression in human skeletalmuscle［J］.Experimental Gerontology，2012，47：417-424.

［14］Guo-Qing Chen，Cai-Ying Mou，Yue-Qin Yang，etal.Exercise training has beneficial anti-atrophy effects by inhibiting oxidative stressinduced MuRF1 upregulation in rats with diabetes［J］.Life Sciences，2011，89：44-49.

［15］Tintignac LA，Lagirand J，Batonnet S，et al.Degradation of MyoD mediated by the SCF（MAFbx）ubiquitin ligase［J］.JBiol.Chem，2005，280：2847-2856.

［16］Musaro A，McCullagh K，Paul A，et al.Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle［J］.Nat.Genet，2001，27：195-200.

責任編輯：郭長壽

Effects of Different Form s of Exercise on Expressions of M uscle Atrophy Related Factors in Gastrocnem ius of M ice

CHEN Caizhen1，2，LU Jian1，2，JILiu1，2
（1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention，M inistry of
Education，East China Normal University，Shanghai200241，China；2.College of Physical Education and Health，East China Normal University，Shanghai200241，China）

Objective：Exercise can lead to skeletal muscle hypertrophy preventing atrophy.Proteolytic events involve the ubiquitination and subsequent degradation of proteinsmarked by E3 ligases.The studyis to exam ine the influence of endurance training and resistance training on the expression of MuRF-1，MAFbx，Caspase-3 and IGF-1mRNA in gastrocnem ius muscle.Methods：21 SAMP8 senile male m ice were random ly distributed into three groups：sedentary（CON，n＝7），endurance training group（n＝7）），resistance training groups（n＝7）.A fter 8wk training，gastrocnem iusmuscles were excised，Muscle-wetweight and bodymass（BM）wereweighed and analyzed by real-time PCR.Results：The ratio ofmuscle wetweight and BM（RM）of resistance training group showed significant differences when compared w ith that of endurance group or controlgroup，8wk endurance training or resistance training resulted in a decrease inmRNA levels of MuRF-1，MAFbx，Caspase-3，whereas two training groups have no significant difference，IGF-1mRNA in two training groupswas significantly higher than that in sedentary，and it is also higher in resistance group than endurance group.Conclusion：Resistance training is better than endurance training inmaintainingmuscle quality effect.Two differentmovementsm ight not be through the samemechanism to influence gastrocnemius quality，and IGF-1 represent potentialmediators implicated in the regulation of MuRF1 and atrogin-1 genes during exercise.

muscle atrophy；ubiquit proteasome system；IGF-1；MuRF-1；MAFbx；Caspase-3；endurance training；resistance training

G804.55

：A

：1004-0560（2014）05-0085-05

2014-06-23；

2014-07-15

“青少年健康評價與運動干預”教育部重點實驗室建設(shè)項目（40500-541235-14203／004）。

陳彩珍（1967—），女，教授，博士，主要研究方向為運動訓練的生物學適應。