劉慧敏俸艷英 高彩云陽(yáng)志軍

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

臨床研究

TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉慧敏△俸艷英 高彩云△陽(yáng)志軍

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 探討跨膜四超家族成員1（transmembrane 4 super family 1，TM4SF1）蛋白在人卵巢組織中的表達(dá)及其與上皮性卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)16例正常卵巢上皮組織、23例上皮性卵巢良性腫瘤組織及55例上皮性卵巢癌癌組織中TM4SF1蛋白的表達(dá)情況，分析其與上皮性卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 ①TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（90.90%）高于上皮性卵巢良性腫瘤組織（65.22%）及正常卵巢上皮組織（25.00%）的陽(yáng)性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②TM4SF1蛋白在正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)主要位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞膜近基底膜處及細(xì)胞質(zhì)中，在卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)主要集中在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜近基底膜處及細(xì)胞膜其他部位，而在卵巢癌細(xì)胞中則主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。③Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，中低分化癌患者TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化癌患者（P<0.05）。④TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)類型、腹水量的多少無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05），而與FIGO分期及組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)（P<0.05）。⑤Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示TM4SF1蛋白在卵巢癌癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)不是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論 TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌癌組織中呈高表達(dá)，可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

卵巢腫瘤；TM4SF1；上皮性卵巢癌；免疫組織化學(xué)

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，其死亡率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居首位，雖然手術(shù)治療和細(xì)胞毒性藥物化療取得了很大進(jìn)步，但卵巢癌發(fā)生、發(fā)展可能涉及的分子作用機(jī)制仍不明確。本課題組前期研究從上皮性卵巢癌患者腹水癌細(xì)胞構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出相關(guān)抗原跨膜四超家族成員1（transmenbrane 4 super family l，TM4SF1），并發(fā)現(xiàn)血清中TM4SF1的自身抗體可作為卵巢癌診斷的血清標(biāo)志物［1］。但TM4SF1蛋白在人卵巢組織中的表達(dá)情況及其在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)不同類型卵巢組織中TM4SF1蛋白的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理特征及其與上皮性卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，以探討TM4SF1蛋白的表達(dá)在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本來(lái)源 組織蠟塊均來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科2008年7月至2012年7月手術(shù)切除的組織標(biāo)本，均經(jīng)病理科專家再次確診。原發(fā)性上皮性卵巢癌患者55例，年齡21~74歲，中位年齡47歲。其中漿液性癌29例，黏液性癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌8例，透明細(xì)胞癌2例。按FIGO（2004）分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ~Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期34例。對(duì)所有上皮性卵巢癌患者進(jìn)行隨訪，中位隨訪時(shí)間為33個(gè)月（1～60個(gè)月），均無(wú)非癌死亡及失訪病例。卵巢良性腫瘤患者23例，年齡23~59歲，中位年齡43歲，其中漿液性瘤13例，黏液性瘤10例。正常卵巢上皮組織患者11例，均來(lái)自因子宮肌瘤或多囊卵巢而行卵巢全部或楔形切除的患者，年齡28~66歲，中位年齡46歲。

1.1.2 主要試劑 一抗兔抗人腫瘤相關(guān)抗原L6多克隆抗體（bs-6242R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化SP超敏試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

采用免疫組化SP法，石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓法修復(fù)抗原20 min，羊血清封閉15 min，一抗按1∶200稀釋后4℃孵育過(guò)夜，羊抗兔二抗37℃孵育1 h，DAB顯色1min，風(fēng)干后封片。陽(yáng)性對(duì)照選用乳腺癌組織，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷

在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒者判斷為TM4SF1蛋白染色陽(yáng)性。隨機(jī)選取5處無(wú)壞死區(qū)域的卵巢組織部位，鏡下（×400）對(duì)每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)綜合判斷該視野得分，分別記錄后取平均分為該切片免疫組化染色得分。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色（-）為0分，淺黃色（+）為1分，棕黃色（++）為2分，棕褐色（+++）為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：≤5%為0分，6%~25%為1分，26% ~50%為2分，51%~75%為3分，>75%為4分。二項(xiàng)計(jì)分之積>3者定為TM4SF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。所有切片均由兩位觀察者獨(dú)立閱片、計(jì)分后取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher′s確切概率法。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TM4SF1蛋白在卵巢組織中的表達(dá)情況

TM4SF1蛋白在不同類型卵巢組織中均有表達(dá)（圖1、表1），在上皮性卵巢癌癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（90.90%）高于卵巢良性腫瘤組織（65.22%）及正常卵巢上皮組織的陽(yáng)性表達(dá)率（25.00%），在卵巢良性腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（65.22%）亦高于正常卵巢上皮組織的陽(yáng)性表達(dá)率（25.00%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。

2.2 TM4SF1蛋白在不同類型卵巢細(xì)胞中的定位情況

TM4SF1蛋白在正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)主要位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜（圖1中C1的黑色箭頭所示）和細(xì)胞膜近基底膜處及細(xì)胞質(zhì)中；在卵巢良性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)主要集中在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜近基底膜處（圖1中E1的黑色箭頭所示）及細(xì)胞膜其他部位，而在卵巢癌細(xì)胞中則主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1中F1的紅色箭頭所示）。

表1 TM4SF1蛋白在卵巢組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況［n（%）］

圖1 免疫組化SP法檢測(cè)TM4SF1蛋白在上皮性卵巢組織中的表達(dá)（SP×400）

2.3 TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系

FIGO分期中Ⅲ～Ⅳ期患者TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期者（P<0.05），中低分化癌患者TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化者（P<0.05）。TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)類型和腹水量的多少無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05），而與FIGO分期及組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 上皮性卵巢癌組織中TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

將TM4SF1蛋白的表達(dá)情況及可能影響預(yù)后的相關(guān)因素如年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、腹水量等，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型先行單因素分析，將其中有意義的因素再進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)和腹水量的多少不是影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P>0.05），而FIGO分期及組織學(xué)分級(jí)是影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的因素（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表2 上皮性卵巢癌患者TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系［n（%）］

表3 影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的單因素分析及多因素分析

3 討論

TM4SF1也稱腫瘤相關(guān)抗原L6（tumor-associated antigen L6，TAAL6），是TM4SF家族的一個(gè)遠(yuǎn)親，在不同的癌組織中呈高表達(dá)，而在許多正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。對(duì)TM4SF家族成員的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析［2］，發(fā)現(xiàn)TM4SF1屬于一個(gè)含有TM4SF4/IL-TMP、TM4SF5/L6H、TM4SF18/L6D、TM4SF19/OCTM4及TM4SF20/TCCE518在內(nèi)的新的超家族。目前雖然對(duì)TM4SF1的確切功能和生理作用還不明確，但Gordon等［3］認(rèn)為TM4SF1是惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)控基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。增加TM4S1蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲能力，抗TM4SF1的單克隆抗體可明顯降低肺癌細(xì)胞的侵襲能力［4］。敲除TM4SF1基因可降低前列腺癌細(xì)胞的遷移及宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［5］。越來(lái)越多的研究表明，TM4SF1對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有重要意義。研究顯示實(shí)體惡性腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新生腫瘤血管的形成。Shih等［6］發(fā)現(xiàn)，TM4SF1蛋白在多種腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）中呈高表達(dá)，并與EC的偽足形成密切相關(guān)，敲除TM4SF1基因可阻止EC的偽足形成、抑制細(xì)胞遷移、阻滯細(xì)胞質(zhì)分裂、促進(jìn)EC衰老，可大量抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）誘導(dǎo)的微血管形成。因此TM4SF1可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TM4SF1蛋白在卵巢良性腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常卵巢上皮組織的陽(yáng)性表達(dá)率，在上皮性卵巢癌癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢上皮組織的陽(yáng)性表達(dá)率；同時(shí)，隨著上皮性卵巢癌FIGO分期的升高、分化程度的降低，TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率亦升高，提示TM4SF1蛋白隨著卵巢上皮細(xì)胞的異常增生和惡性轉(zhuǎn)變其表達(dá)升高，隨著臨床期別的升高其表達(dá)亦升高。由此，我們認(rèn)為TM4SF1蛋白與上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。

動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明［4］，增加TM4SF1蛋白的表達(dá)可縮短荷瘤動(dòng)物模型的生存期，TM4SF1蛋白的高表達(dá)與肺鱗癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)及短的生存期明顯相關(guān)。因此，Gordon等［3，7］認(rèn)為TM4SF1可用于預(yù)測(cè)腫瘤患者手術(shù)預(yù)后。本研究結(jié)果并未顯示TM4SF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)是上皮性卵巢癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，這可能是由于TM4SF1蛋白在晚期上皮性卵巢癌中呈高表達(dá)，而晚期上皮性卵巢癌患者的預(yù)后本來(lái)就明顯差于早期患者，同時(shí)本研究樣本數(shù)量相對(duì)較少，這些可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TM4SF1蛋白在細(xì)胞中的定位隨著組織學(xué)類型的不同而改變，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似［5］。Zukauskas等［8］的研究表明，TM4SF1可以與EC細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架蛋白相互作用，促進(jìn)微小偽足的形成、促進(jìn)細(xì)胞極性化和轉(zhuǎn)移，但過(guò)表達(dá)的TM4SF1蛋白可破壞細(xì)胞的極性。Knust等［9］認(rèn)為，細(xì)胞極性的產(chǎn)生是由于細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)部的某些分子在特定部位的選擇性聚集而致。極性改變不僅可引起細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞行為的改變［10］，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［11］。因此，我們猜測(cè)TM4SF1蛋白在卵巢組織不同細(xì)胞中表達(dá)部位的改變可能引起細(xì)胞極性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致上皮性卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。但免疫組化SP法屬于酶標(biāo)免疫組織化學(xué)方法，用光學(xué)顯微鏡觀察蛋白亞細(xì)胞定位有一定局限性和主觀性，因此TM4SF1蛋白在卵巢上皮組織細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位需要借助激光共聚焦顯微鏡或者免疫電鏡進(jìn)行觀察，同時(shí)其定位變化可能在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌組織中呈高表達(dá)，可能介導(dǎo)了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制有待更深入研究。

［1］ 陽(yáng)志軍，楊 光，蔣艷明，等.上皮性卵巢癌相關(guān)抗原的篩選和血清學(xué)檢測(cè)［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2007，42（12）：834-839.

［2］ Wright MD，Ni J，Rudy GB.The L6 membrane proteins-a new fourtransmembrane superfamily［J］.Protein Sci，2000，9（8）：1594-1600.

［3］ Gordon GJ，Bueno R，Sugarbaker DJ.Genes associated with prognosis after surgery for malignant pleural mesothelioma promote tumor cell survival in vitro［J］.BMC Cancer，2011，11：169.

［4］ Kao YR，Shih JY，Wen WC，et al.Tumor-associated antigen L6 and the invasion of human lung cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2003，9（7）：2807-2816.

［5］ Allioli N，Vincent S，Vlaeminck-Guillem V，et al.TM4SF1，a novel primary androgen receptor target gene over-expressed in human prostate cancer and involved in cell migration［J］.Prostate，2011，71（11）：1239-1250.

［6］ Shih SC，Zukauskas A，Li D，et al.The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis［J］.Cancer Res， 2009，69（8）：3272-3277.

［7］ Gordon GJ，Dong L，Yeap BY，et al.Four-gene expression ratio test for survival in patients undergoing surgery for mesothelioma［J］.J Natl Cancer Inst，2009，101（9）：678-686.

［8］ Zukauskas A，Merley A，Li D，et al.TM4SF1：a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration［J］.Angiogensis，2011，14（3）：345-354.

［9］ Knust E.Regulation of epithelial cell shape and polarity by cell-cell adhesion（Review）［J］.Mol Membr Bilo，2002，19（2）：113-120.

［10］St Johnson D，Ahringer J.Cell polarity in eggs and epithelia：parallels and diversity［J］.Cell，2010，141（5）：757-774.

［11］Ellenbroek SI，Iden S，Collard JG.Cell polarity proteins and cancer［J］. Senmin Cancer Biol，2012，22（3）：208-215.

［2013-11-18收稿］［2014-02-28修回］［編輯 阮萃才］

Expression and clinical significance of TM4SF1 protein in epithelial ovarian cancer

LIU Hui-min△，F(xiàn)ENG Yan-ying，GAO Cai-yun△，YANG Zhi-jun（Department of Gynecologic Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）
Corresponding auther：YANG Zhi-jun.E-mail：yzj7528@126.com

Objective To investigate the expression of transmembrane 4 super family 1（TM4SF1）protein in human ovarian tissues and its relationship with clinicopathological factors.Methods The SP immunohistochemical method was used to analyze the expression of TM4SF1 protein in 16 normal ovarian epithelial tissues，23 benign ovarian tumor tissues and 55 epithelial ovarian cancer（EOC）tissues.Relationships of TM4SF1 expression with clinicopathological features of EOC and patient prognosis were analyzed.Result①EOC tissues showed a significantly higher rate of TM4SF1 protein expression（90.90%）than did benign ovarian tumor tissues（65.22%）or normal ovarian epithelial tissues（25.00%，P<0.05）.②The TM4SF1 protein showed markedly different localizations in various tissue types.In normal ovarian epithelial tissues，the protein localized primarily to the membranes and the basal surface of epithelial cells as well as cytoplasts;in benign ovarian tumors，the protein was observed mainly on the basal surface and in certain parts of tumor cell membranes；in EOC tissues，TM4SF1 showed a mainly cytoplasmic staining.③Rate of TM4SF1 protein expression was significantly higher in tissues of patients with stageⅢ-ⅣEOC than in patients with stageⅠ-Ⅱdisease（P<0.05）.The rate of TM4SF1 protein expression was also significantly higher in tissues showing low-to intermediate tumor differentiation than in well-differentiated carcinomatissues（P<0.05）.④Rate of TM4SF1 protein expression showed no significant association with histological type or amount of ascites（P>0.05），but association with FIGO stage and histological grade（P＜0.05）.⑤Cox multivariate analysis showed that positive expression of TM4SF1 protein was not an independent prognostic factor.Conclusion TM4SF1 protein is overexpressed in EOC tissue，so it may be associated with the disease.

Ovarian neoplasm；TM4SF1；Epithelial ovarian cancer；Immunohistochemistry

R737.31

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360387）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012GXNSFAA053135）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研課題（重2010077）

陽(yáng)志軍。E-mail：yzj7528@126.com