張 彧黃天壬陳 鈴何國珍鄧 偉張春燕

作者單位：530021 南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院輸血科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；530001 南寧3廣西中醫(yī)藥大學(xué)

臨床研究

去唾液酸糖蛋白受體2基因在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及意義

張 彧△黃天壬1陳 鈴2何國珍3鄧 偉1張春燕1

作者單位：530021 南寧1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院輸血科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；530001 南寧3廣西中醫(yī)藥大學(xué)

目的 檢測去唾液酸糖蛋白受體2（asialoglycoprotein receptor 2，ASGR2）基因在肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的表達(dá)水平，探討ASGR2在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。方法 以RT-PCR法檢測55例HCC患者、55例非肝癌的其他腫瘤患者和33例非腫瘤的其他疾病對照患者外周血液中ASGR2基因的表達(dá)水平，并分析其意義。結(jié)果 肝癌組和非肝癌的其他腫瘤組患者血液中ASGR2基因陽性表達(dá)率分別為85.5%、65.5%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），肝癌組和非腫瘤的其他疾病對照組ASGR2基因陽性表達(dá)率分別為85.5%、78.8%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），ASGR2基因在3組患者外周血液中的表達(dá)水平有明顯差異（P＜0.05）。ASGR2基因的表達(dá)與HCC患者的性別、年齡、AFP、肝硬化、腫瘤家族史等臨床病理特征均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 ASGR2基因的表達(dá)水平可能與HCC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，檢測ASGR2的水平有望作為HCC早期發(fā)病的預(yù)測指標(biāo)。

肝腫瘤；肝細(xì)胞性肝癌；去唾液酸糖蛋白受體2；基因；表達(dá)

去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是一種跨膜蛋白，其特異性地表達(dá)在肝臟竇狀隙細(xì)胞表面。ASGPR主要由兩個亞基組成，體內(nèi)糖蛋白的去唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）和去唾液酸糖蛋白受體2（ASGR2）兩個亞基聯(lián)合具有內(nèi)吞作用［1］。ASGPR能夠結(jié)合血液循環(huán)中的N-乙酰氨基半乳糖基和末端帶有半乳糖基的糖蛋白在肝細(xì)胞中進(jìn)行代謝［2］。近年來，許多研究提示ASGPR是肝癌基因治療研究最多的靶向受體［3］。本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（RT-PCR），從mRNA水平檢測肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血液中ASGR2基因的表達(dá)情況，探討其在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

肝癌組：55例外周血液標(biāo)本來自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2012年11月至2013年1月手術(shù)切除的HCC患者，其中男性45例，女性10例，年齡32～74歲，平均年齡50.9歲。其中伴有肝炎者占56.36%，甲胎蛋白陽性者占24.07%。全組病理診斷均為HCC。非肝癌的其他腫瘤組：55例全血標(biāo)本來自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院非肝癌的其他腫瘤患者，其中男性40例，女性15例，年齡24～72歲，平均年齡51.2歲。病理診斷均無肝臟轉(zhuǎn)移。非腫瘤的其他疾病對照組：33例全血標(biāo)本來自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院非腫瘤的其他疾病患者，其中男性19例，女性14例，年齡13～68歲，平均年齡38.0歲。所有標(biāo)本的疾病均經(jīng)病理學(xué)及臨床檢查證實。標(biāo)本采集均征得患者知情同意。

1.2 主要試劑

全血RNA提取試劑盒（Catrimox-14 RNA Isolation Kit）為寶生物工程（大連）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司。

1.3 方法

采集研究對象空腹靜脈血液2 ml，以EDTA-Na抗凝，取100 μl全血按Catrimox-14 RNA Isolation Kit試劑盒說明書的方法抽提總RNA。取2 μl RNA在酶標(biāo)儀上測定RNA濃度。基因引物如下：內(nèi)參為GAPDH，上游引物為5′-AAG AAG GTG GTG AAG CAG GC-3′；下游引物為5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC-3′。ASGR2基因的上游引物為5′-AAC ACA CGA ACC CCT TCA ATA C-3′；下游引物為5′-CCT CCT TTC TCT CTT TGC TCA G-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性96℃10 min，變性98℃10 s，退火55～60℃30 s，延伸72℃1 min/kbp，30個循環(huán)，最后延伸72℃7 min。PCR反應(yīng)體積共50 μl，Premix Ex Taq25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板2 μl，滅菌蒸餾水21 μl。RT-PCR產(chǎn)物半定量分析：取10 μl PCR產(chǎn)物和5 μl Marker經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V 30 min，核酸染料10 μl/100 ml。用RT-PCR法檢測ASGR2基因在肝癌組、非肝癌的其他腫瘤組及非腫瘤的其他疾病對照組中的表達(dá)水平，在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。ASGR2基因在肝癌組、非肝癌的其他腫瘤組和非腫瘤的其他疾病對照組患者外周血液中的表達(dá)率和表達(dá)量采用χ2檢驗和t檢驗進(jìn)行比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASGR2基因表達(dá)的陽性率

ASGR2基因在肝癌組患者中的陽性表達(dá)率為85.5%，在非肝癌的其他腫瘤組患者中的陽性表達(dá)率為65.5%，在非腫瘤的其他疾病對照組患者中的陽性表達(dá)率為78.8%。肝癌組與非肝癌的其他腫瘤組比較，ASGR2基因陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.939，P＜0.05）；肝癌組與非腫瘤的其他疾病對照組比較，ASGR2基因陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.648，P＞0.05）。見表1。

表1 ASGR2基因在各組患者中陽性表達(dá)的情況［n（%）］

2.2 ASGR2基因RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

ASGR2基因在肝癌組、非肝癌的其他腫瘤組和非腫瘤的其他疾病對照組的表達(dá)見圖1。ASGR2基因擴增產(chǎn)物長度為391 bp。

圖1 ASGR2基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果注：M.marker；A、B.肝癌組；C、D.非肝癌的其他腫瘤組；E.非腫瘤的其他疾病對照組；G1～G5.GAPDH。

2.3 ASGR2基因的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

ASGR2基因的表達(dá)水平與HCC患者的性別、民族、年齡、AFP、肝炎、吸煙、飲酒、肝硬化和腫瘤家族史等臨床病理特征的關(guān)系均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 ASGR2基因表達(dá)水平的比較

RT-PCR分析顯示肝癌組患者ASGR2 mRNA的相對表達(dá)量為（1.026±0.058），明顯高于非肝癌的其他腫瘤組的（0.395±0.093），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.089，P=0.000），亦明顯高于非腫瘤的其他疾病對照組的（0.764±0.061），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=37.638，P=0.000）。3組患者ASGR2 mRNA的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=114.670，P＜0.05）。

表2 ASGR2基因的表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系（n）

3 討論

肝臟竇狀隙細(xì)胞表面富含ASGPR，體內(nèi)糖蛋白被去唾液酸作用后通過ASGPR途徑在肝細(xì)胞內(nèi)被吸收，提示其在肝癌的基因靶向治療中具有潛在的應(yīng)用前景［4］。目前，國內(nèi)外對ASGPR的研究比較活躍，尤其在ASGPR基因的肝癌基因治療及抗HBV的研究較多。ASGPR在肝癌細(xì)胞表面大量表達(dá)，腫瘤靶向藥物可利用ASGPR的介導(dǎo)遞送到HCC［5，6］。有研究報道反義寡糖核苷酸（ASODN）能下調(diào)ASGPR的表達(dá)水平，在不影響其他正常細(xì)胞的同時明顯抑制HBV的復(fù)制［7，8］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上［9］，應(yīng)用RTPCR技術(shù)，從mRNA水平檢測ASGR2基因在肝癌組、非肝癌的其他腫瘤組和非腫瘤的其他疾病對照組患者外周血液中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，肝癌組和非腫瘤的其他疾病對照組間ASGR2 mRNA的陽性表達(dá)無差異（P＞0.05），而與非肝癌的其他腫瘤組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步將ASGR2基因在3個組中表達(dá)的mRNA進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明ASGR2基因在肝癌組患者外周血液中的mRNA表達(dá)水平明顯高于非肝癌的其他腫瘤組和非腫瘤的其他疾病對照組（P均＜0.05），提示ASGR2基因表達(dá)水平的升高可能與HCC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示ASGR2基因的表達(dá)水平與HCC患者的性別、年齡、AFP、肝炎、吸煙、飲酒、肝硬化和腫瘤家族史等臨床病理特征均無相關(guān)性（P均＞0.05）。

綜上，本研究表明肝癌組患者外周血液中ASGR2 mRNA的表達(dá)水平較非肝癌的其他腫瘤組和非腫瘤的其他疾病對照組升高，提示外周血液中ASGR2基因的表達(dá)可能對HCC的早期診斷有意義，檢測ASGR2基因的表達(dá)有望作為HCC發(fā)病的預(yù)測指標(biāo)。本研究未采集各種肝病標(biāo)本與肝癌標(biāo)本進(jìn)行對比，其原因已有研究報道ASGPR與多種肝臟相關(guān)疾病如病毒性肝炎、肝硬化和肝癌密切相關(guān)［10，11］。近年來，ASGPR介導(dǎo)的肝臟相關(guān)疾病靶向藥物的釋放、轉(zhuǎn)運、代謝、排泄機制等尚未清晰［12］，有待進(jìn)一步研究，以在肝臟疾病防治方面發(fā)揮更大作用。

［1］ Ashwell G，Harford J.Carbohydrate-specific receptors of the liver［J］. Annu Rev Biochem，1982，51：531-554.

［2］ Grewal PK，Uchiyama S，Ditto D，et al.The Ashwell receptor mitigates the lethal coagulopathy of sepsis［J］.Nat Med，2008，14（6），648-655.

［3］ Wu J，Nantz MH，Zern MA.Targeting hepatocytes for drug and gene delivery：emerging novel approaches and applications［J］.Front Biosci，2002，7：717-725.

［4］ Treichel U，Meyer zum Büschenfelde KH，Dienes HP，et al.Receptormediated entry of hepatitis B virus particles into liver cells［J］.Arch Virol，1997，142（3）：493-498.

［5］ Jeong YI，Seo SJ，Park IK，et al.Cellular recognition of paclitaxelloaded polymeric nanoparticles composed of poly（gamma-benzyl-L-glutamate）and poly（ethylene glyco1）diblock copolymer endcapped with galactose moiety［J］.Int J Pharm，2005，296（1～2）：151-161．

［6］ Diaz C，Vargas E，Gatjens-Boniche O.Cytotoxic effect induced by retinoic acid loaded into galactosyl-sphingosine containing liposomes on human hepatoma cell lines［J］.Int J Pharm，2006，325（1～2）：108-115．

［7］ Yang J，Box C，Ding XR，et al.Antisense oligonucleotides targeted against asialoglycoprotein receptor 1 block human hepatitis B virus replication［J］.J Viral Hepat，2006，l3（3）：158-165．

［8］ 丁曉然，楊 靜，伯曉晨，等.靶向ASGPR的反義核酸與抗HBV藥物聯(lián)合用藥的體外抗HBV作用［J］.病毒學(xué)報，2006，22（1）：18-21．

［9］ 張春燕，黃天壬.差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其在篩選肝癌血清標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.中國癌癥防治雜志，2009，1（1）：72-73.

［10］Nguyen TH，F(xiàn)erry N.Liver gene therapy：advances and hurdles［J］. Gene Ther，2004，11（Suppl 1）：76-84.

［11］王煒煜，曹利民，羅 劍，等.靶向去唾液酸糖蛋白受體多功能分子的構(gòu)建及抗肝癌效應(yīng)［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（10）：1627-1631.

［12］ Zhang SQ，Lian JF.Targeted drug delivery-pharmacy research hotspot［J］.J Fourth Mil Med Univ，2005，26（22）：2017-2020．

［2013-10-13收稿］［2013-11-26修回］［編輯 阮萃才］

Asialoglycoprotein receptor 2 gene expression and significance in hepatocellular carcinoma

ZHANG Yu△，HUANG Tian-ren1，CHEN Ling2，HE Guo-zhen3，DENG Wei1，ZHANG Chun-yan1（1Department of Research，Guangxi Cancer Institute；2Department of blood transfusion，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University；3Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530021，P.R.China）

HUANG Tian-ren.E-mail：tianrenhuang@yahoo.com.cn

Liver neoplasms；Hepatocellular carcinoma；Asialoglycoprotein receptor 2；Gene；Expression

R735.7

A

1674-5671（2014）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.04

國家自然科學(xué)基金資助項目（30960333）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（桂科自0991017Z）；廣西高?？蒲许椖浚酃鸾炭蒲校?003）22號］

黃天壬。E-mail：tianrenhuang@yahoo.com.cn

【Abstract】Objective To explore the expression and possible significance of asialoglycoprotein receptor 2（ASGR2）gene in hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods Expression of the ASGR2 gene in peripheral blood was detected by RT-PCR in 55 patients with hepatocellular carcinoma，55 patients with non-HCC tumors，and 33 non-tumor control patients.Results Expression of the ASGR2 gene was detected in significantly more HCC patients（85.5%）than in non-HCC patients（65.5%，P<0.05）；in fact，the rate of positive expression was similar among HCC patients as in non-cancer controls（78.8%，P＞0.05）.Gene expression differed significantly across all three patient groups（P<0.05）.ASGR2 gene expression was not significantly associated with clinicopathological features of HCC，age，AFP，cirrhosis，or cancer family history（P＞0.05）.Conclusion ASGR2 gene expression may be associated with HCC development，and detecting expression may serve as an early predictor of pathogenesis.