許 颯寧淑芳 利基林 馮 雁 唐艷萍 駱成飄 張力圖

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

人肝癌細(xì)胞系中CD90+細(xì)胞的生物學(xué)特性

許 颯△寧淑芳 利基林 馮 雁 唐艷萍 駱成飄 張力圖

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 篩選肝癌細(xì)胞系中CD90（Thy-1）陽性表達(dá)的細(xì)胞，初步探討CD90+細(xì)胞亞群的干細(xì)胞特性。方法 利用流式細(xì)胞分選術(shù)篩選5種肝癌細(xì)胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及SK-Hep-1）中CD90（Thy-1）陽性表達(dá)的細(xì)胞，以平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察其增殖能力，CCK-8法觀察CD90+細(xì)胞的增殖能力和順鉑對CD90+細(xì)胞的抑制率。結(jié)果 肝癌細(xì)胞株Sk-Hep-1中有66.02%的細(xì)胞CD90呈陽性表達(dá)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示CD90+細(xì)胞克隆形成率為（18.60±2.95）%，顯著高于CD90-細(xì)胞及未分選細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體外實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)4 d后CD90+細(xì)胞的增殖較CD90-及未分選細(xì)胞明顯加快；CD90+細(xì)胞在相同濃度的順鉑作用下其抑制率較CD90-細(xì)胞和未分選細(xì)胞明顯降低，三者的抑制率分別為14.8%、29.7%和24.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 肝癌細(xì)胞中的CD90+細(xì)胞是具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，CD90可能是肝癌干細(xì)胞候選的分子標(biāo)志物。

肝腫瘤；流式細(xì)胞分選術(shù)；CD90；Thy-1；干細(xì)胞；順鉑；抗藥性，腫瘤；生物學(xué)特性

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是世界上第六大常見癌癥［1］，近年來雖然腫瘤的診斷和治療技術(shù)在不斷更新和發(fā)展，但肝癌死亡率仍居高不下，每年約有60萬人死于此病，其死亡率在男性腫瘤中位居第二位［2］。肝臟切除術(shù)和肝移植是HCC主要的治療方法［3］，但術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的比例仍較高。1977年Hamburger等［4］在干細(xì)胞的理論基礎(chǔ)上提出了“腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）”的概念，使人類對腫瘤有了更多新的認(rèn)識。目前，我們對肝癌干細(xì)胞的研究還處于探索階段。2008年Yang等［5，6］從肝癌組織中分離獲得肝癌干細(xì)胞，在肝癌中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在。本實(shí)驗(yàn)主要研究腫瘤干細(xì)胞的分選和肝癌細(xì)胞系中CD90的表達(dá)情況，并初步探討CD90+細(xì)胞體外增殖、抗藥性等特性，為進(jìn)一步研究肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM（高糖）、RPMI-1640和胎牛血清均購自美國Hyclone公司，鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液購自揚(yáng)子江藥業(yè)有限責(zé)任公司，鼠抗人CD90單克隆抗體購自美國eBioscience公司，5種肝癌細(xì)胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403和Sk-Hep-1）由廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部提供。流式細(xì)胞分選儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞株的培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清和10 μl/ml鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的DMEM（高糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)。余4種肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及Sk-Hep-1）分別用含10%胎牛血清、10 μl/ml鹽酸左氧氟沙星的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為研究對象。

1.2.2 流式細(xì)胞分選術(shù)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測肝癌細(xì)胞株中CD90的表達(dá) 選取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞株，用不含EDTA的0.25%胰酶分別消化，培養(yǎng)液終止消化，吹打、制備單細(xì)胞懸液，離心（1 000 r/min，5 min）去上清液，計(jì)數(shù)并調(diào)整每管細(xì)胞數(shù)量為1×107個細(xì)胞。用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌，離心，制備單細(xì)胞懸液，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD90 5 μl，用PBS將終體積定至100 μl，室溫避光孵育30 min，并設(shè)立陰性對照。用含2%胎牛血清的PBS洗滌細(xì)胞兩次，離心去上清液，每管加入500 μl含2%胎牛血清的PBS吹打，制備單細(xì)胞懸液，過濾，以流式細(xì)胞分選儀檢測細(xì)胞中CD90的表達(dá)量。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察抗體標(biāo)記的細(xì)胞 根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物，利用FACS從Sk-Hep-1細(xì)胞株中分選出CD90+細(xì)胞。收集分選出的CD90+細(xì)胞，取適量細(xì)胞懸液滴于載玻片，避光靜置20 min，待細(xì)胞沉淀后，利用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞的熒光表達(dá)情況。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞體外增殖能力 將分選獲得的CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞和未分選的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋至1×104/ml，接種至96孔板，每孔0.2 ml，每孔設(shè)置8個平行孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次液體，用CCK-8法分別在1 d、3 d、5 d、7 d測定各種細(xì)胞的增殖情況。

1.2.5 細(xì)胞耐藥能力的比較 將CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞和未分選的細(xì)胞亞群，以2 500個細(xì)胞/孔接種至96孔板，每種細(xì)胞設(shè)置對照組和加藥組，每組設(shè)8個復(fù)孔。輕輕晃動96孔板以混勻細(xì)胞，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，將每種細(xì)胞的加藥組加入濃度為12 μmol/L的順鉑培養(yǎng)基200 μl，對照組加入等量不含順鉑的完全培養(yǎng)基，48 h更換1次相應(yīng)培養(yǎng)基，96 h后采用CCK-8法檢測A450值，計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（A0-Am）/A0×100%。A0為對照組A450值，Am為加藥孔A450值。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將流式細(xì)胞分選儀分選出CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞，在6孔板中接種1 000個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每種細(xì)胞接種3個孔，輕輕晃動6孔板使細(xì)胞分布均勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時，棄掉培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，以PBS液輕洗3次，用吉姆薩染色15 min，流水緩慢沖洗染料，待孔板干燥后于顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)（≥50個細(xì)胞為1個克?。Ｆ桨蹇寺⌒纬陕剩?）=形成的克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)× 100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)量資料的比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FACS分選的結(jié)果

經(jīng)FACS分選得出肝癌細(xì)胞株HepG2中CD90的陽性表達(dá)率為0.15%，Sk-Hep-1中CD90的陽性表達(dá)率為66.02%，其余細(xì)胞株均未檢測到CD90的陽性表達(dá)。見圖1。

2.2 熒光顯微鏡檢測分選細(xì)胞的純度

在熒光顯微鏡下觀察分選后的CD90+細(xì)胞，CD90陽性表達(dá)的SK-Hep-1細(xì)胞在顯微鏡下可見95%以上細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)出綠色熒光（圖2）。表明本實(shí)驗(yàn)經(jīng)FACS分選所獲得細(xì)胞純度較高。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞體外增殖的能力

CCK-8法檢測CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞和未分選細(xì)胞的增殖能力。從圖3可見，自培養(yǎng)的第3天開始，CD90+細(xì)胞的增殖快速，而未分選的細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的增殖緩慢，到第7天，CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞和未分選細(xì)胞的A450值分別為1.056±0.027、0.567±0.019和0.805±0.021，CD90+細(xì)胞較后兩者細(xì)胞的增殖明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 熒光顯微鏡下觀察分選后CD90陽性表達(dá)的SK-Hep-1細(xì)胞（×200）

圖3 CCK-8法檢測CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞及未分選細(xì)胞的生長曲線

2.4 細(xì)胞耐藥能力的比較

以CCK-8法對CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞和未分選細(xì)胞抵抗順鉑的能力進(jìn)行檢測。經(jīng)12 μmol/L的順鉑培養(yǎng)4 d，3種細(xì)胞的生長抑制率分別為14.8%、29.7%和24.0%。CD90+細(xì)胞的抑制率明顯低于其余兩種細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 在12 μmol/L的順鉑作用下3種細(xì)胞的生長抑制率

2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測3種細(xì)胞的克隆形成數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD90+細(xì)胞的克隆形成率為（18.60±2.95）%，CD90-細(xì)胞的克隆形成率為（3.77±1.44）%，未分選細(xì)胞為（11.17±1.92）%，表明CD90+細(xì)胞的克隆形成率明顯高于CD90-細(xì)胞和未分選細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測3種細(xì)胞的克隆形成數(shù)

3 討論

為了尋找患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特異性療法，因此對腫瘤干細(xì)胞的研究一直是熱點(diǎn)課題［7］，而分選腫瘤干細(xì)胞是對干細(xì)胞特性研究的第一步。目前，鑒定腫瘤干細(xì)胞最權(quán)威的方法是確定腫瘤干細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面的標(biāo)志［8］。有研究表明CD90標(biāo)志的細(xì)胞分子參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展［9］，因此必須根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志分選出腫瘤干細(xì)胞。目前肝癌干細(xì)胞的分離方法主要有磁性激活細(xì)胞分選術(shù)（magnetic activated cell sorting，MACS）和FACS，后者也稱熒光激活細(xì)胞分選術(shù)。MACS較簡單且容易操作，但分離細(xì)胞的效率和精確度相對較低，適用于對分選細(xì)胞純度要求相對較低的實(shí)驗(yàn)；FACS雖操作復(fù)雜，但分選后的細(xì)胞純度和精確度較高，細(xì)胞回收率也相對較高，因此更適用于含量相對較低的細(xì)胞分選。這兩種分選方法共同的特點(diǎn)均依賴于腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志。因此本實(shí)驗(yàn)采用FACS分選CD90+細(xì)胞。

CD90是一種25~37 kDa的糖蛋白，通過甘油二酯（DAG）固定于糖磷脂酰肌醇（GPI）的C末端，附著在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面。CD90在細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用、細(xì)胞的凋亡、黏附、遷移、腫瘤演進(jìn)和纖維化都起到十分重要的作用［10］。Saalbach等［11］研究證實(shí)，Thy-1（CD90）是人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志，它在腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移過程中可能起某種作用。另外，Herrera等［12］的研究表明，CD90表達(dá)于肝干細(xì)胞/肝祖細(xì)胞中（hepatic stem/progenitor cells，HSPCs）。2008年Yang等［5，6］成功地從肝癌組織中分離獲得肝癌干細(xì)胞，并證明表達(dá)CD90的肝癌細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性，是肝癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)從肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1中篩選出CD90+細(xì)胞，其CD90的陽性表達(dá)率為66.02%，這與 Yamashita等［13］研究肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1中CD90陽性表達(dá)率為59.00%的數(shù)據(jù)相近。

本實(shí)驗(yàn)成功地從肝癌細(xì)胞系中分選出CD90+細(xì)胞，并用免疫熒光染色法對分選細(xì)胞進(jìn)行純度評估，結(jié)果表明通過FACS分選可獲得高純度的CD90+細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中對CD90+細(xì)胞、CD90-細(xì)胞及未分選細(xì)胞的生長曲線進(jìn)行分析以及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CD90+細(xì)胞的增殖能力及克隆形成能力均高于CD90-細(xì)胞及未分選細(xì)胞，這與文獻(xiàn)［14］報道的結(jié)果一致；在抗藥性實(shí)驗(yàn)的研究中，CD90+細(xì)胞的抗藥性明顯比CD90-細(xì)胞和未分選的細(xì)胞強(qiáng)，這與以往的研究結(jié)果相似［15］。由此說明肝癌細(xì)胞中的確存在一部分細(xì)胞的生物學(xué)特性與其他細(xì)胞不同。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)FACS分選的SK-Hep-1細(xì)胞株中CD90的陽性表達(dá)率高于HepG2中CD90的陽性表達(dá)率，而其余3株肝癌細(xì)胞均未檢測到CD90的陽性表達(dá)，可能與細(xì)胞不同的生物學(xué)特性有關(guān)，有關(guān)方面值得深入研究。

本實(shí)驗(yàn)通過FACS從5種肝癌細(xì)胞株中篩選出CD90+細(xì)胞，并進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明CD90+細(xì)胞具有生長迅速、克隆形成率高和抗藥性強(qiáng)等腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。今后我們將篩選出的細(xì)胞亞群接種于裸鼠體內(nèi)，觀察各細(xì)胞亞群的體內(nèi)成瘤能力等特性，為肝癌干細(xì)胞的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ Forner A，Llovet JM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］.Lancet，2012，379（9822）：1245-1255.

［2］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［3］ Mazzaferro V，Regalia E，Doci R，et al.Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis［J］.N Engl J Med，1996，334（11）：693-699.

［4］ Hamburger AW，Salmon SE.Primary bioassay of human tumor stem cells［J］.Science，1977，197（4302）：461-463.

［5］ Yang ZF，Ngai P，Ho DW，et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer［J］.Hepatology，2008，47（3）：919-928.

［6］ Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

［7］ Mishra L，Banker T，Murray J，et al.Liver stem cells and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2009，49（1）：318-329.

［8］ Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［9］ 張珍妮，匡志鵬，楊 帆，等.肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD90在化學(xué)誘癌過程中的動態(tài)變化［J］.中國癌癥防治雜志，2012，4（2）：127-130.

［10］Rege TA，Hagood JS.Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration，apoptosis，adhesion，migration，cancer，and fibrosis［J］.Faseb J，2006，20（8）：1045-1054.

［11］ Saalbach A，Hildebrandt G，Haustein UF，et al.The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1-positive microvascular endothelial cells［J］.Microvasc Res，2002，64（1）：86-93.

［12］Herrera MB，Bruno S，Buttiglieri S，et al.Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver［J］.Stem Cells，2006，24（12）：2840-2850.

［13］ Yamashita T，Honda M，Nakamoto Y，et al.Discrete nature of EpCAM+and CD90+cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，57（4）：1484-1497.

［14］王海麗，文 忠，申聰香，等.人鼻咽癌CD133+干細(xì)胞的生物學(xué)特性及意義［J］.中國組織工程研究，2012，16（6）：1007-1010.

［15］Zhu Z，Hao X，Yan M，et al.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma［J］. Int J Cancer，2010，126（9）：2067-2078.

［2014-01-05收稿］［2014-02-25修回］［編輯 阮萃才］

Biological Characteristics of CD90+Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines

XU Sa△，NING Shu-fang，LI Ji-lin，F(xiàn)ENG Yan，TANG Yan-ping，LUO Cheng-piao，ZHANG Li-tu（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHANG Li-tu.E-mail：zhanglitu@gmail.com

Objective To isolate CD90+（Thy-1+）cells from human hepatocellular carcinoma（HCC）cell lines and to study their stem cell properties.Methods Fluorescence-activated cell sorting was used to detect CD90 expression in five HCC cell lines：HepG2，SMMC-7721，Bel-7404，Bel-7403 and SK-Hep-1.The tablet clone formation test was used to measure the colony-forming ability of the sorted CD90+cells，and the CCK-8 assay was used to analyze their proliferation ability and their sensitivity to cisplatin.Results CD90 expression was detected in 66.02%of Sk-Hep-1 cells.The pelletizing rate of these CD90+cells was（18.6±2.95）%in the tablet colony formation assay，significantly higher than that of CD90-and unsorted cells（P＜0.05）.Proliferation after 4 days in culture was significantly greater for CD90+cells than for CD90-and unsorted cells.Cisplatin inhibited growth of CD90+cells by 14.8%，significantly less than it inhibited the growth of CD90-cells（29.7%，P＜0.05）and unsorted cells（24.0%，P＜0.05）.Conclusion CD90+cells are a subpopulation with tumor stem cell properties.CD90 may be a candidate biomarker for HCC stem cells.

Hepatocellular neoplasm；Fluorescence-activated cell sorting；CD90；Thy-1；Stem cell；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Biological characteristics

R735.7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.03

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃課題（桂科攻1355005-3-10）；廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（GXMUYSF201215）

張力圖。E-mail：zhanglitu@gmail.com