溫會玲，陳玉燕

（青島科技大學 化學與分子工程學院，山東 青島 266042）

近年來，金屬配合物作為DNA分子識別的研究取得了長足的進展，發(fā)現(xiàn)了一批具有DNA特異識別屬性的小分子配合物，為新型基因選擇性藥物的篩選提供了重要信息。金屬配合物已經(jīng)廣泛用于DNA結(jié)構(gòu)探針、DNA分子開關(guān)、DNA足跡試劑以及DNA斷裂試劑等研究領(lǐng)域[1,2]。苯并咪唑類化合物與金屬配合物的研究一直是生物無機化學、醫(yī)藥及材料科學等領(lǐng)域十分活躍的研究課題[3]。本文用紫外光譜、電化學方法研究了2-（喹啉-8-氧甲基）苯并咪唑鎘配合物與DNA的相互作用，結(jié)果表明，該配合物可以作為ssDNA和dsDNA的結(jié)構(gòu)識別探針。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

石墨粉（上海膠體化工廠）；高效切片石蠟（上海華靈康復器械廠）；pH值為4鄰苯二甲酸氫鉀標準液（上海雷磁儀器廠）。鯡魚精DNA（dsDNA，Sigma產(chǎn)品），使用前未進一步提純，測得A260/A280>1.80，表示其純度符合要求。dsDNA濃度以堿基對表示，通過 260nm（ε260=6600L·mol-1·cm-1）處吸光度確定。變性單鏈DNA（ssDNA）根據(jù)文獻制備[4]。所有溶液都用二次蒸餾水制備。2-（喹啉-8-氧甲基）苯并咪唑（L）鎘配合物[Cd（L）Cl2（H2O）]晶體按文獻方法合成[5]，其它試劑均為分析純。

CHI832電化學分析儀；pHS-25型酸度計；三電極系統(tǒng)：飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑片電極為對電極，碳糊電極為工作電極；DZF-150型真空干燥箱；TU-1810紫外-可見分光光度計。

1.2 紫外光譜

用 0.1mol·L-1HOAc-NaOAc（pH值為 4.0）緩沖液稀釋儲備液，得到4.60×10-5mol·L-1配合物溶液，在含4.60×10-5mol·L-1配合物溶液中加入相同量的dsDNA（ssDNA），搖勻，充分反應，在200～900nm進行紫外光譜測定。

紫外滴定實驗：配制4.60×10-5mol·L-1配合物溶液，準確量取3mL于石英比色皿中，測定配合物的紫外光譜，逐次向配合物溶液中加入一定量dsDNA或ssDNA溶液，搖勻充分反應后,分別測定其紫外譜圖。

1.3 電化學研究

在含 5.67×10-5mol·L-1Cd配合物的 0.1mol·L-1HOAc-NaOAc緩沖液（pH值為4.0）中，加入相同濃度的dsDNA或ssDNA，充分反應，以碳糊電極為工作電極進行電化學測定。在5.62×10-5mol·L-1配合物中加入不同濃度的dsDNA，充分反應后，測定其微分脈沖伏安曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物與DNA的相互作用

圖1為配合物與DNA相互作用的循環(huán)伏安圖。

圖1 配合物與dsDNA、ssDNA相互作用的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of complex in the absence（a）and presence of dsDNA（b）and ssDNA（c）

配合物于0.178V出現(xiàn)一個氧化峰，其峰電流為5.724×10-7A，0.106V出現(xiàn)一個還原峰，峰電流為1.861×10-7A，氧化還原峰峰形良好。ΔEp=Epc-Epa=72mV，Ipa/Ipc=3.07，由此可見，該氧化還原過程屬于不可逆過程。

與dsDNA或ssDNA充分反應后，氧化峰電流明顯減小，加入ssDNA后峰電流更小，說明其與DNA發(fā)生了相互作用，且與ssDNA的作用更強；配合物的式電位從0.142V負移至0.133V和0.128V（見表1）,根據(jù)文獻知，當電活性小分子與DNA發(fā)生靜電作用時，電化學電位向負移動；產(chǎn)生嵌插作用時，向正方向移動。由此說明Cd配合物與DNA間主要是靜電作用，此外，ssDNA暴露于外部的堿基也可能與配合物發(fā)生了相互作用，使得ssDNA與配合物作用更強。配合物與dsDNA和ssDNA不同的作用模式和作用強度，使Cd配合物有可能用于DNA二級結(jié)構(gòu)的識別。

表1 Cd配合物結(jié)合DNA前后的電化學參數(shù)Tab.1 Electrochemical data of Cd complex in the absence and presence of DNA

研究了加入DNA前后，電位掃描速度對配合物循環(huán)伏安曲線的影響，結(jié)果表明，無論DNA是否存在，配合物的氧化峰電流都與掃速（v）成良好的線性關(guān)系，說明配合物在電極上的電化學行為主要受吸附控制。

對于一個吸附控制的不可逆過程，根據(jù)Laviron公式，氧化峰電位（Ep）與掃速（v）之間存在如下關(guān)系：

E0′是式電位，α是電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，n是電化學過程中轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，k0是電化學速率常數(shù)。以Ep對ln v作圖（圖 2），得到 Ep=0.0262ln v+0.2354（γ=0.999），計算得到αn=0.9637，則n=1.93，說明該氧化過程是一個2電子過程，對應于Cd→Cd2+的過程。

圖2 峰電位E p與L nv關(guān)系圖Fig.2 Plot of peak potential E p versus L nv

在5.62×10-5mol·L-1的Cd配合物中加入不同濃度的dsDNA后，測定其微分脈沖伏安曲線（圖3），隨著dsDNA濃度的增加，樣品的峰電流逐漸減小，當 dsDNA濃度為5.589×10-5mol·L-1時，樣品的氧化峰電流趨于穩(wěn)定，說明配合物與dsDNA間的反應達到飽和狀態(tài)。

圖3 配合物微分脈沖伏安圖Fig.3 Differential pulse voltammograms of the complex

將加入dsDNA后配合物的氧化峰電流（I pa）對dsDNA的濃度做圖，見圖4。

圖4 配合物的氧化峰電流與DNA濃度的關(guān)系Fig.4 Plotof peak current Ipa versus CDNA

由圖4可見，配合物的峰電流與dsDNA濃度在兩個濃度區(qū)間呈良好的線性關(guān)系，線性關(guān)系式分別為Ipa/（10-7A）=2.4094C+9.94（γ=0.9999）。Ipa/（10-7A）=-0.3412C+4.1067（γ=0.983）。因此，該配合物有望用于DNA的定量分析。

2.2 紫外光譜法研究配合物與DNA相互作用

圖5 配合物與DNA相互作用的紫外吸收光譜Fig.5 UV-vis spectra of complex in the absence and presence of DNA

由圖5可見，在配合物溶液中加入dsDNA或ssDNA后，所有的吸收峰都未出現(xiàn)紅移，說明配合物與DNA間不存在嵌插作用，而是以靜電作用為主。所有吸收峰均產(chǎn)生減色效應，加入ssDNA后減色效應更明顯。即配合物與ssDNA的作用更強，該結(jié)論與電化學研究結(jié)果一致。

利用紫外滴定法測定了配合物與dsDNA、ssDNA的結(jié)合能力，圖6為配合物與dsDNA紫外滴定譜圖。

圖6 配合物與dsDNA的紫外滴定譜圖Fig.6 UV-vis titration spectra of complex

依據(jù)方程式CDNA/（εa-εf）=CDNA/（εb-εf）+1/Kb（εa-εf），以CDNA/（εa-εf）對CDNA作圖為一直線，直線方程為 y=5.0254x+2.5966（γ2=0.9755），斜率與截距的比值即為結(jié)合常數(shù)Kb（dsDNA）=1.935×104L·mol-1。同理得到Kb（ssDNA）=4.462×104L·mol-1。結(jié)合常數(shù)的測定從實驗數(shù)據(jù)上進一步證明配合物與ssDNA作用更強。

3 結(jié)論

應用紫外光譜和電化學方法研究了2-（喹啉-8-氧甲基）苯并咪唑鎘配合物與DNA的相互作用，結(jié)果表明，該配合物可以作為ssDNA和dsDNA二級結(jié)構(gòu)識別探針。微分脈沖伏安實驗結(jié)果證明，該配合物有望用于DNA的定量分析，可能共存的干擾物質(zhì)對DNA定量檢測的影響將在后續(xù)實驗中進行。

[1] Uma V,Kanthimathi M,Weyhermuller T,et al.Oxidative DNA cleavagemediated by a new copper（II）terpyridine complex:Crystal structureand DNA binding studies[J].JInorg Biochem,2005,99:2299-2307.

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[3] Loganathan R,Ramakrishnan S,Suresh E,etal.Mixed ligand copper（II）complexes of N,N-bis（benzimidazol-2-ylmethyl）amine（BBA）with diimine co-ligands:efficient chemical nuclease and protease activities and cytotoxicity[J].Inorg Chem.,2012,51：5512-5532.

[4] Pang DW,Abruna H D.Micro method for the investigation of the interactions between DNA and redox-active molecules[J].Anal.Chem.,1998,70:3162-3169.

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